Что такое репарация в медицине

Публикации в СМИ

Дефекты репарации ДНК

Репарация — клеточный механизм коррекции повреждённой последовательности ДНК (точечные мутации, делеции, структурные нарушения и др.).

Системы репарации

• Темновая (фотореактивация): удаляются УФ-индуцированные ковалентные связи между смежными основаниями ДНК.

• Эксцизионная: удаляет неправильно спаренные или повреждённые основания из ДНК с последующим синтезом новой последовательности по неповреждённой цепи. Состоит из 5 этапов, контролируемых множеством генов, кодирующих участвующие в репарации ферменты (эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза): распознавание дефекта, рассечение повреждённого участка, удаление «ошибочного» олигонуклеотида, синтез ДНК с использованием комплементарной цепи как матрицы, лигирование. Дефекты эксцизионной репарации регистрируют при пигментной ксеродерме, синдроме Коккейна, трихотиодистрофии.

• Рекомбинационная: для восстановления одной хромосомы используется материал гомолога. Дефекты рекомбинационной репарации регистрируют при синдроме Блума.

Приложение. Трихотиодистрофия — наследственное заболевание с ломкостью волос и ногтей (из-за уменьшенного содержания богатых цистеином матричных белков), ихтиозиформными изменениями кожи, физической и умственной отсталостью. Генетические аспекты: 50% пациентов имеют повышенную фоточувствительность, связанную с дефектом эксцизионной репарации ДНК (#601675, гены ERCC2/XPD и ERCC3/XPB, r ). Клиническая картина: ломкие волосы и ногти, ихтиоз, небуллёзная ихтиозиформная эритродермия, фоточувствительность, недоразвитие подкожной клетчатки, задержка физического развития, низкая масса плода при рождении, умственная отсталость, кишечная непроходимость, гипогонадизм, амастия, катаракта, микроцефалия, бронхиальная астма, контрактуры суставов, частые инфекционные заболевания. Лабораторные данные: снижение содержания богатого цистеином белка в волосах и ногтях, гипогаммаглобулинемия. Синонимы: синдром Тэя, врождённый ихтиоз с трихотиодистрофией. МКБ-10. L67.8 Другие аномалии цвета волос и волосяного стержня.

Код вставки на сайт

Дефекты репарации ДНК

Репарация — клеточный механизм коррекции повреждённой последовательности ДНК (точечные мутации, делеции, структурные нарушения и др.).

Системы репарации

• Темновая (фотореактивация): удаляются УФ-индуцированные ковалентные связи между смежными основаниями ДНК.

• Эксцизионная: удаляет неправильно спаренные или повреждённые основания из ДНК с последующим синтезом новой последовательности по неповреждённой цепи. Состоит из 5 этапов, контролируемых множеством генов, кодирующих участвующие в репарации ферменты (эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимераза, ДНК-лигаза): распознавание дефекта, рассечение повреждённого участка, удаление «ошибочного» олигонуклеотида, синтез ДНК с использованием комплементарной цепи как матрицы, лигирование. Дефекты эксцизионной репарации регистрируют при пигментной ксеродерме, синдроме Коккейна, трихотиодистрофии.

• Рекомбинационная: для восстановления одной хромосомы используется материал гомолога. Дефекты рекомбинационной репарации регистрируют при синдроме Блума.

Приложение. Трихотиодистрофия — наследственное заболевание с ломкостью волос и ногтей (из-за уменьшенного содержания богатых цистеином матричных белков), ихтиозиформными изменениями кожи, физической и умственной отсталостью. Генетические аспекты: 50% пациентов имеют повышенную фоточувствительность, связанную с дефектом эксцизионной репарации ДНК (#601675, гены ERCC2/XPD и ERCC3/XPB, r ). Клиническая картина: ломкие волосы и ногти, ихтиоз, небуллёзная ихтиозиформная эритродермия, фоточувствительность, недоразвитие подкожной клетчатки, задержка физического развития, низкая масса плода при рождении, умственная отсталость, кишечная непроходимость, гипогонадизм, амастия, катаракта, микроцефалия, бронхиальная астма, контрактуры суставов, частые инфекционные заболевания. Лабораторные данные: снижение содержания богатого цистеином белка в волосах и ногтях, гипогаммаглобулинемия. Синонимы: синдром Тэя, врождённый ихтиоз с трихотиодистрофией. МКБ-10. L67.8 Другие аномалии цвета волос и волосяного стержня.

Источник

Что такое репарация в медицине

Молекула ДНК является носителем генетической информации в клетке каждого живого существа, ее целостность и стабильность имеют важное значение для жизни. При этом ДНК постоянно атакуется эндогенными метаболитами, лекарственными препаратами, электромагнитными излучениями и множеством других мутагенов окружающей среды, которые влияют на целостность этой молекулы. Например, ультрафиолетовые лучи вызывают образование пиримидиновых димеров, 4,6-фотопродуктов, аддуктов, разрывов ДНК [6]. Под действием химических агентов происходят разного рода модификации нуклеотидов, возникают межнитевые сшивки, конформационные дефекты. К тому же известно, что структура молекулы ДНК может изменяться в процессе репликации: ДНК-полимераза, синтезируя новую цепь, делает ошибки, вставляя некомплементарные нуклеотиды. Скорость, с которой ДНК-полимераза добавляет неправильные нуклеотиды в процессе репликации ДНК, является важным фактором, определяющим частоту возникновения спонтанных мутаций в организме. Вставка ошибочного нуклеотида обычно распознается сразу, в процессе репликации, и исправляется самими полимеразами, но некоторые мутации все-таки «ускользают» от правки и сохраняются на дочерней нити. Кроме того, обычным повреждением является спонтанное отщепление оснований, достигающее 10 тыс. событий на геном человека в сутки [79].

Поскольку молекулы ДНК являются для клетки уникальными и невосполнимыми, в процессе эволюции сформировалась сложная система восстановления структуры ДНК, включающая несколько механизмов репарации и сотни белков, обеспечивающих процесс восстановления нормальной структуры ДНК. В реализации некоторых механизмов репарации достаточно участия только одного фермента, но большинство механизмов обеспечиваются несколькими ферментами, и это определяет сложность, многоэтапность процесса восстановления нативной структуры ДНК. К таким сложным многоэтапным процессам относится эксцизионная репарация ДНК (от excision (англ.) – удаление, вырезание). Выделяют три типа эксцизионной репарации, свои названия они получили от типа исправляемого повреждения.

1. Эксцизионная репарация оснований (base excision repair, BER).

2. Эксцизионная репарация неспаренных оснований (mismatch repair, MMR).

3. Эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER).

Все эти виды эксцизионной репарации имеют общие этапы: распознавание повреждения; надрезание нити ДНК (сахарофосфатного остова); эксцизия (удаление) участка, содержащего повреждение; репаративный синтез на неповрежденной матрице и лигирование. При этом, несмотря на лежащий в их основе общий процесс вырезания участка ДНК с повреждением, они принципиально различаются между собой.

Эксцизионная репарация оснований

Основные повреждения ДНК, удаляемые при BER – неправильно спаренные, окисленные, алкилированные и т.п. основания [11]. Такие повреждения не приводят к нарушению репликации, но являются источником мутаций.

Инициирующими BER белками являются гликозилазы, которые распознают и удаляют поврежденные или неправильные основания, гидролизуя N-гликозидную связь между сахарофосфатным остовом и поврежденным основанием [60, 96]. На сегодняшний день в клетках млекопитающих идентифицировано не менее 11 различных гликозилаз, которые отличаются по субстратной специфичности и репарируемым повреждениям [108]. Обычно определенные гликозилазы репарируют определенные повреждения [11, 43]. Среди гликозилаз млекопитающих можно выделить четыре структурно различных группы: урацил-ДНК-гликозилазы, спираль-шпилька-спираль-гликозилазы, 3-метилпурингликозилазы и эндонуклеаза-VIII-подобные гликозилазы. Несмотря на их структурное разнообразие, все ДНК-гликозилазы используют механизм «отгибания оснований» (base-flipping), при котором основание-мишень перед отщеплением отгибается в сторону от спирали ДНК. Выделяют гликозилазы I и II типа [24]. I тип гликозилаз только удаляет модифицированные основания и оставляет в молекуле ДНК апуриновый/апиримидиновый сайт (АП-сайт). II тип гликозилаз сперва удаляет измененное основание, а затем расщепляет нить как 3′-эндонуклеаза и формирует однонитиевый разрыв. После гликозилазы I типа разрез фосфофдиэфирной связи совершает АП-эндонуклеаза. Это специальная АП-эндонуклеаза APE1 (син.: APEX, Ref-1, HAP-1) [23, 56, 82, 115]. АРЕ1 (AP endonuclease-1) активируется при взаимодействии с белком XRCC1 (X-ray-induced damage repair cross comlementating) и действует с ним в комплексе [113].

Независимо от механизма разрыва фосфодиэфирной связи, в качестве промежуточной стадии образуется разрыв нити ДНК в котором 3′ и 5′-концы модифицированы и блокируют последующую работу репарационных ферментов. Чтобы процесс репарации мог завершиться, эти блокирующие концы должны быть преобразованы в обычные 3′-ОН и 5′-фосфатные концы. Это необходимо для реакции с ДНК-полимеразой и далее с ДНК-лигазой. Удаление этих изменённых концов производится разными ферментами, в зависимости от того, произошёл ли разрез с 3′ или 5′-стороны от АП-сайта. Например, APE1 помимо своей основной АП-эндонуклеазной активности обладает также 3′-фосфодиэстеразной активностью, позволяющей ей восстанавливать 3′-ОН конец из 3′-фосфо-α, β-ненасыщенного альдегида. 3′-фосфатный конец, образующийся в результате действия некоторых двухфункциональных ДНК-гликозилаз, преобразуется в 3′-ОН конец посредством 3′-фосфатазной активности PNKP (3′-фосфатазной полинуклеотидкиназы) [1]. АП-сайты и однонитевые разрывы ДНК должны быть обработаны как можно скорее, поскольку они высокотоксичны и мутагенны [79].

На следующем этапе BER происходит заполнение разрыва посредством синтеза ДНК. Синтез происходит по двум путям, короткозаплаточному (short-patch) и длиннозаплаточному (long-patch), в зависимости от того, вставляется в ДНК один нуклеотид или несколько. Короткозаплаточная BER составляет 80-90 % всей BER.

При short-patch BER ДНК-полимераза β (Pol β) вытесняет 5′-дезоксирибоза-5-фосфат и в цепи образуется брешь, напротив которой в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид. Затем, эта же Pol β вставляет комплементарный нуклеотид, присоединяя его к свободному 3’ ОН-концу [17, 70, 100].

Также Pol β участвует в long-patch BER, но вставляет только первый нуклеотид в поврежденный АП-сайт, начиная от 3’-ОН конца [18,91]. Затем Pol β диссоциирует с поврежденной цепи ДНК и дальнейший синтез осуществляется PCNA-зависимыми полимеразами Pol δ или Pol ε путем репарации длинными фрагментами [26, 71]. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) способствует фиксации этих полимераз на цепи ДНК и удерживает их, пока идет синтез фрагмента длиной 2-12 нуклеотида [62]. Одновременно с присоединением нового нуклеотида эти полимеразы вытесняют нуклеотид с поврежденным 5′-концом и последующие нуклеотиды, которые образуют отделенный от матричной цепи «болтающийся» олигонуклеотид – flap structure.

В результате, разрыв в репарируемой цепи ДНК смещается в сторону от первоначального участка повреждения, а небольшой «лишний» отрезок цепи нуклеотидов удаляется с помощью эндонуклеазы FEN1 (Flap endonuclease-1, флэп-эндонуклеазa-1), также зависящей от PCNA [50,69]. FEN1 присоединяется к 5′-концу свисающего участка, перемещается к месту разветвления на этой цепи ДНК и гидролизует связь [62]. Помимо репарации этот фермент принимает активное участие в репликации ДНК: при удалении праймера фрагментов Оказаки также образуются свисающие (flap) концы [114].

Лигирование фосфодиэфирной связи осуществляется ДНК-лигазами I и III. Лигаза I взаимодействует PCNA и Pol β, но участвует в основном в длиннозаплаточной BER [92,101]. ДНК-лигаза III взаимодействует с XRCC1, Pol β и PARP-1 и включается только в короткозаплаточной BER [52,109]. Также важную роль в регуляции BER играет белок p53. In vitro этот белок стимулирует BER, непосредственно взаимодействуя с APE and Pol β, стабилизируя Pol β и связывая ее с АП-сайтом [16].

Репарация неспаренных оснований

Этот вид репарации исправляет ошибки, возникшие в процессе удвоения ДНК. В ходе репликации с частотой от 1:10000 до 1:100000 полимеразы вставляют некомплементарные нуклеотиды. Такие, ошибочно вставленные, основания называются мисмэтчи (mismatches). После неверно вставленного нуклеотида полимеразы в большинстве случаев не способны продолжить работу из-за того, что в этом месте в двойной спирали образуется пузырь или впячивание, наличие которых не позволят полимеразе добавить следующий нуклеотид к растущему 3’-ОН-концу. Остановка в работе полимеразы дает возможность экзонуклеазам, сопровождающим все репликативные полимеразы, удалить неспаренный нуклеотид с 3’-конца вновь синтезируемой цепи. Этот процесс очень эффективен и увеличивает точность репликации на два порядка. Таким образом, белкам MMR приходится иметь дело только с теми ошибками репликации, которым удалось избежать этого корректирующего механизма [46]. Чаще ошибочно вставляются те нуклеотиды, которые производят минимум искажений спиральной структуры [3].

Мисмэтчи представляют собой уникальный тип повреждений, так как целиком состоят из неповреждённых оснований и являются исключительно дефектами структуры. Также мишенью MMR являются петли на одной из нитей ДНК, образовавшиеся вследствие делеции или вставки нуклеотидов (петли делеции/вставки, ПДВ). Специфика таких повреждений состоит в том, что после следующего процесса репликации и разделения нитей ДНК ПДВ расправляются и по ним синтезируется новая дочерняя нить, которая будет длиннее или короче нативной. Если до следующей репликации эти изменения не будут исправлены, у половины потомства клетки окажется ДНК с мутациями [44, 46].

Механизмы различения дочерней цепи, содержащей ошибки, и материнской – эталонной цепи, находятся в процессе исследования. Было выяснено, что для активации экзонуклеаз необходимо наличие на репарируемой нити уже имеющегося разрыва. Предполагают, что у эукариот маркерами, отличающими материнскую нить от дочерней, являются нелигированные разрывы фрагментов Оказаки. Работы T. Kunkel показали, что при пострепликативной MMR эксцизия инициируется у 3’-конца дочерней ДНК и, возможно, у 5’-концов фрагментов Оказаки [53].

Основным белком-инициатором MMR является MSH2, который обнаруживает ошибку в структуре нити ДНК и, в зависимости от типа повреждения образует гетеродимер либо с MSH6 либо с MSH3: для коррекции мисмэтча требуется MSH6, а для исправления ПДВ необходимо участие и MSH6 и MSH3 [35].

После ассоциации MSH2 со вторым белком образуются комплексы-MutSα или MutSβ, которые формируются на нити ДНК в месте локализации ошибки. Ферменты семейства Mut получили это название, потому что ещё до выясненя их функций было замечено, что мутации в кодирующих их генах приводят к резкому повышению частоты возникновения новых мутаций.

MutSα состоит из белков MSH2 и MSH6 [22, 54]. MutSα содержит 80-90 % всего клеточного MSH2 и преимущественно опознает несоответствие оснований и ПДВ, в которых петля содержит 1 или 2 непарных нуклеотида. Также ограниченно способен распознавать ПДВ большей протяженности [19, 28, 86].

MutSβ включает в себя белки MSH2 и MSH3 [2, 86]. MutSβ распознает ПДВ протяженностью от 2-х до 10 нуклеотидов, слабо распознает однонуклеотидные ПДВ, и практически инертен к ошибочно спаренным основаниям [28, 85].

Белки MSH2 и MHS6 содержат АТФ/АДФ-связывающие сайты [33].

Возможность использовать несколько различных белков группы MSH в разных комбинациях придаёт системе MMR у эукариот значительную гибкость, так как эти белки несколько различаются по свойствам. Субъединица MSH6 содержит высококонсервативный аминоконцевой мотив Gly-Phe-Glu, который можно найти уже в белках MMR прокариот. Этот участок вводится в двойную спираль ДНК и взаимодействует с одним из неправильно спаренных оснований, что приводит к изгибу ДНК на 60 °. Взаимодействие стабилизируется образованием водородных связей между глутаматом и атомами N3 и N7 неспаренного основания [77]. ПДВ размером в 1-2 основания распознаются с помощью содержащегося в той же субъединице фенилаланина. В комплексе MutSβ непосредственно связывается с повреждениями субъединица MSH3. Она использует для связи с ПДВ разного размера остатки лизина и тирозина и изгибает ДНК на 90 °. Эта субъединица также способна связывать небольшие мисмэтчи и участвует в исправлении аддуктов, двунитевых разрывов и повторяющихся триплетов [38, 106]. Интересно, что субъединица MSH2, которая не участвует в связывании мисмэтчей, когда она находится в составе MutSα, в составе MutSβ способна связывать крупные ПДВ.

Аминокислоты, опознающие повреждения ДНК, находятся на N-концах соответствующих белков MSH, тогда как их карбоксильные концы образуют АТФ-связывающие домены [93]. Ещё ранние эксперименты показали, что MSH, будучи связанным с мисмэтчем, претерпевает под воздействием АТФ изменение конформации.

После связывания с мисмэтчем MutSα ассоциируется с другим гетеродимерным комплексом MutLα, состоящим из белков MLH1 и PMS2 [57,78].

Комплекс MutLα объединяет и координирует взаимодействие между белками, распознающими несоответствия, и другими белками MMR.

В ходе исследований выяснилось, что субъединица PMS2 комплекса MutLα обладает скрытой эндонуклеазной активностью, которая, будучи активированной, приводит к образованию дополнительных разрывов в нити ДНК, уже содержащей хотя бы один инициирующий разрыв [47].

После связывания гетеромера MutSα с мисмэтчем происходит обмен АДФ на АТФ и MutSα превращается в «скользящий зажим», а после присоединения к нему гетеромера MutLα весь комплекс начинает скользить (перемещаться) вдоль оси ДНК пока не встречает еще один комплекс белков – PCNA (proliferating cell nuclear antigen). PCNA является кольцеобразным гомотримером, имеющим две чётко различимых поверхности. На ДНК он загружается с помощью специального загрузчика RFC (replication factor C) с 3’-стороны от ближайшего разрыва и всегда одной и той же поверхностью к 3’-концу. На 3’-субстрате это приводит к активации скрытой эндонуклеазной активности MutLα и образованию дополнительных разрывов по обе стороны от мисмэтча [89].

Для активации эндонуклеазной активности MutLα необходимо присоединение PCNA. Будучи загруженным, кольцо может свободно вращаться вокруг продольной оси ДНК, но неспособно развернуться. Из этого вытекает, что когда PCNA связывает своих партнеров с ДНК, вновь образовавшиеся комплексы имеют фиксированную ориентацию, которая сохраняется даже после перемещения комплекса на значительное расстояние от места первоначальной сборки. После связывания с PCNA ориентация MutLα фиксирована. Поскольку MutLα имеет всего один сайт с эндонуклеазной активностью, он будет разрезать только одну нить ДНК, причём направление разрезания будет зависеть от того, на какой из сторон PCNA он окажется расположен. Остается невыясненным, почему новые разрывы производятся преимущественно в окрестностях дефекта. Вероятным объяснением является то, что производящая разрезы эндонуклеаза является частью не просто комплекса MutLα с PCNA, но комплексом PCNA с уже объединёнными MutLα и MutSα, а так как их объединение активируется дефектом, то и количество комплексов вблизи дефекта будет максимальным [90].

На этапе удаления мисмэтча или ПДВ подключается экзонуклеаза I (Exo1), которая является 5’> 3’-экзонуклеазой [29, 32]. Exo1 загружается на разрывы активированным комплексом MutSα/MutLα и создаёт пробел в нити ДНК, начинающийся с разрыва и заканчивающийся примерно в 150 нуклеотидах после дефекта [74].

Восстановление ПДВ длиннее двух-трёх нуклеотидов, как предполагалось, имеет механику, идентичную описанной, но с использованием MutSα вместо MutSα.. Впрочем, недавние исследования ставят это под сомнение. В исследовании R.R. Iyer с сотрудниками показано, что MLH1 и PCNA, по-видимому, связываются с MSH3 в одном и том же участке (или на частично перекрывающихся участках) [40]. Таким образом MutSα не может взаимодействовать с MutLα и PCNA одновременно. Кроме того, кольцо PCNA не могло бы мигрировать на 5’-сторону от крупной петли и обеспечить там работу Exo1.

Незначительное участие в репарцях, определяемых MutSα, может принимать и комплекс MutLα (MLH1 и MLH3) [10].

Восстановление структуры дочерней нити ДНК выполняет ДНК-полимераза α (pol α). Для надежной фиксации Pol α на цепи также необходимы комплексы PCNA и RFC [65]. Завершается процесс MMR соединением концов сахарофосфатного остова репарированной дочерней нити и образованием фосфодиэфирной связи. Этот процесс осуществляет ДНК-лигаза I [45, 58, 74].

Эксцизионная репарация нуклеотидов

Эксцизионная репарация нуклеотидов является универсальным механизмом репарации ДНК. NER одним и тем же набором ферментов может распознавать самые разнообразные повреждения, искажающие спираль ДНК. При этом повреждения не обладают сходной химической структурой, но их объединяет то, что все они дестабилизируют двойную спираль ДНК и являются массивными [39].

Белки, реализующие NER, вначале распознают повреждение, затем раскручивают молекулу ДНК, удаляют олигонуклеотид, содержащий поврежденный нуклеотид, восстанавливают последовательность нуклеотидов на поврежденной нити и сшивают молекулу. Низкая специфичность этого вида репарации определяется тем, что удаляется не только модифицированный нуклеотид, но цепочка нуклеотидов, в ряду которых находится и поврежденный [12, 111].

На этапе распознавания повреждения различают два варианта эсцизионной репарации нуклеотидов: NER, реализуемая по всему геному, и NER, связанная с транскрипцией [30,36].

NER по всему геному – GG-NER (global genome nucleotide excision repair). При этом виде NER поиск и удаление объемных повреждений осуществляется во всем геноме, включая нетранскрибируемые участки и молчащий хроматин. GG-NER инициируется комплексом XPC/HR23B/CEN2 (XP complementation group C, Rad23 homolog B, Centrin-2, – белок XP с комплементационной группой C; гомолог B белка Rad 23; центрин-2).

В этом комплексе HR23B и CEN2 являются вспомогательными белками, которые увеличивают сродство и прочность связывания XPC с поврежденной спиралью ДНК. Оба этих белка присутствуют в клетке в парциальном изобилии и их истощение делает клетку чувствительной к УФ [80]. Помимо этих белков, ДНК-связывающая способность XPC в целом коррелирует со степенью искажения спирали ДНК [97]. Белок HR23B, кроме структурной, имеет также и более специфическую функцию, стимулируя процесс опознания повреждений. После опознания повреждения HR23B диссоциирует от XPC [6,73].

Комплекс XPC/HR23B постоянно движется вдоль молекулы ДНК, распознает повреждения и служит матрицей, на которой осуществляется сборка ключевых факторов, реализующих удаление повреждения и репарацию этого участка. При этом элемент XPC распознаёт термодинамически неустойчивый участок молекулы [105].

XPC имеет два основных функциональных домена [72]. ДНК-связывающий домен, неспецифичный как к последовательности связываемой ДНК, так и к типу повреждения, состоит, в свою очередь, из трансглутамаза-гомологичного домена и β-шпилька-домена (BHD1), заякоривающего белок на ДНК. Двойной β-шпилька-домен (BHD2/3) связывает неповреждённую нить ДНК, не вступая с повреждением в прямой контакт и вместо этого охватывая два нуклеотида, расположенные напротив повреждения. Этот «карман связывания» специфичен для неповреждённой ДНК и не мог бы вместить массивные аддукты. Таким образом, XPC прикрепляется только к неповреждённой нити ДНК. Такой характер связывания делает возможным для XPC связывать большое разнообразие структурно различных массивных повреждений [63].

NER, связанная с транскрипцией – TC-NER (transcription-coupled nucleotide excision repair). В этом случае поиск и удаление объемных повреждений осуществляется в транскрибируемых участках. Инициируется TC-NER остановкой РНК-полимеразы II перед повреждённым участком ДНК [25]. Затем белки CSA и CSB вытесняют РНК-полимеразу, освобождая место повреждения для белков NER [36]. Комплекс белков TFIIH способствует переключению с РНК-полимеразного комплекса (с РНК-полимеразой II) на комплекс NER. При этом транскрипционный аппарат не разрушается. После завершения репарации к цепи ДНК вновь присоединяются CSA и CSB и транскрипция РНК-полимеразным комплексом продолжается [110]. TC-NER активируют не только объемные повреждения, но и повреждения, которые обычно репарируются в процессе BER [16].

Независимо от способа распознавания повреждения и инициации репарации, процесс восстановления нативной структуры ДНК реализуется по одному механизму [30, 36]. К месту повреждения подходят 10 белков и объединяются в мультифункциональный транскрипционный фактор TFIIH (multi-functional transcription factor ). TFIIH состоит из 10 субъединиц. В образовавшемся комплексе можно выделить центральную часть (состоящую из XPB, p52, p8, p62, p34, p44) и циклинактивируемый комплекс (CAK, состоит из CDK7, циклина H и MAT1), а также соединяющий их белок XPD [15.] CAK от TFIIH диссоциирует и непосредственно в NER не участвует [4, 14].

Затем, две ассоциированные с TFIIH АТФ-зависимые геликазы XPB и XPD раскручивают спираль ДНК и образуют «пузырь» длиной примерно в 30 нуклеотидов по обеим сторонам от повреждения [25, 36, 107].

В исследованиях на археях, имеющих свой аналог XPB, было установлено, что этот белок обеспечивает прикрепление комплекса TFIIH к ДНК, а также обладает важной для процесса NER АТФазной активностью. В процессе прикрепления к ДНК белок претерпевает значительные структурные изменения [21]. Как XPB, так и XPD являются каталитическими ферментами, служащими движущей силой всего TFIIH в NER.

Роль остальных субъединиц также постепенно начинает проясняться. Показано, что p52 стимулирует активность XPB, а p44 тесно взаимодействует с XPD и также стимулирует его деятельность [13]. Неожиданно важной оказалась роль p8, самой маленькой из субъединиц. В её отсутствие нарушается разделение двойной спирали ДНК и присоединение XPA [14].

Присоединением XPD завершается сборка первичного комплекса NER. Далее к участку повреждения независимо друг от друга присоединяются XPA, RPA и XPG, а XPC-HR23B на этом этапе от комплекса отделяется. Центральным элементом комплекса теперь служит XPA [31]. Этот белок взаимодействует практически со всеми остальными и его вероятная роль заключается в том, чтобы все части комплекса NER находились на своих местах к тому моменту, как будет произведён надрез.

Особенно тесно XPA сотрудничает с белком RPA, связывающим однонитевую ДНК и состоящим из трех субъединиц (RPA70, RPA32 и RPA14). Считается, что XPA и RPA совместно связываются с ДНК [94]. Оптимальный участок связывания ДНК для RPA состоит примерно из 30 нуклеотидов, то есть как раз такой, какой подвергается вырезанию при NER. Полагают, что RPA прикрепляется к неповреждённой нити ДНК, и тем самым помогает двум эндонуклеазам ERCC1-XPF и XPG разместиться на их субстрате – повреждённой нити ДНК. RPA играет важную роль в координации событий эксцизии и репаративного синтеза [84].

XPG играет в NER структурную и ферментативную функцию. Структурно-специфичная эндонуклеаза XPG присоединяется к TFIIH и, по-видимому, остаётся с ним связанной, по крайней мере, при исполнении некоторых из своих функций [40]. После завершения сборки комплекса XPG производит разрез ДНК с 3’-конца, после чего разрезает 5’-конец. С другой стороны, недавнее исследование предполагает, что первой разрез совершает как раз ERCC1-XPF, для чего ему требуется присутствие, но не активность XPG [20]. Это подтверждается сведениями о том, что репарационный синтез может начаться и пройти до половины длины заполняемого разрыва ещё до инцизии ДНК ферментом XPG [102].

Инцизия рестриктазой XPF оставляет свободную 3’-гидроксильную группу, от которой репликационный механизм может сразу начать репарационный синтез. Напротив, разрезание XPG оставляет после себя 5’-фосфат, который не может служить началом для синтеза и необходим только на этапе лигирования [34].

Комплекс из TFIIH, XPA, RPA и XPG относительно устойчив и эксцизия запускается только после присоединения ERCC1-XPF, которая рекрутируется белком XPA [83].

После вырезания повреждённого олигонулеотида, он остаётся связанным с TFIIH. Затем TFIIH присоединяет АТФ, а от олигонуклеотида освобождается. Освободившийся олигонуклеотид связывается с RPA и впоследствии подвергается разложению [49].

На основании исследований in vitro считалось, что заполнение разрыва происходит с участием обычных факторов репликации: ДНК-полимераз δ и ε, скользящего «зажима» PCNA, пентамера RFC, который устанавливает «зажим» и RPA [4, 98]. Недавние исследования показали, что этот процесс на самом деле более сложен. Первой неожиданностью оказалось участие подверженной частым ошибкам ДНК-полимеразы κ. Предполагается, что она работает совместно с ДНК-полимеразой δ. Совместно эти две полимеразы осуществляют приблизительно 50 % NER. Остальные 50 %, вероятно, производит ДНК-полимераза ε. Для того, чтобы принимать участие в NER, каждая из трёх ДНК-полимераз требует своих факторов-партнеров. Для активации полимеразы δ необходимы RFC и PCNA. Для полимеразы κ – PCNA и XRCC1 (белок, участвующий в BER). Для полимеразы ε – модифицированная форма RFC, содержащая Ctf18. Отличаются ли чем-либо функционально пути репарации с использованием различных ДНК-полимераз, пока неизвестно [81].

Механизм последней стадии процесса NER – лигирования разрыва, оставшегося после репарационного синтеза – зависит от пролиферационного статуса клетки. Первоначально считалось, что оно осуществляется только с помощью ДНК-лигазы I, но, как выяснилось, активное участие принимают также ДНК-лигаза IIIα и XRCC1. В клетках, находящихся в состоянии покоя, ДНК-лигаза IIIα и ДНК-полимераза δ для NER абсолютно необходимы, а в реплицирующих клетках они также используются, тогда как ДНК-полимераза ε и ДНК-лигаза I используются исключительно в реплицирующих клетках [75].

Как и при всех операциях, совершаемых над ДНК, при NER необходима поддержка белков, модифицирующих хроматин, для получения доступа к нужным участкам ДНК. В общем случае при этом требуется участие двух компонентов: модификатора хвостовых частей гистонов, чтобы уменьшить сродство гистонов к ДНК, и АТФ-зависимых ферментов, переформирующих хромосомы, чтобы иметь возможность перемещать гистоны вдоль ДНК [99]. Исследования показали, что, как и следовало ожидать, NER замедляется при полностью сформированных нуклеосомах, и может неспецифически усиливаться в присутствии перестраивающих хроматин ферментов класса SNF2/SFI2 [37].

В общих чертах механизм NER был известен уже к началу нашего века, однако исследования последнего десятилетия смогли значительно детализировать понимание разных стадий процесса, в особенности, касающихся сборки репаративного комплекса, опознания повреждений и роли NER в функционировании клетки в целом.

Лауреаты Нобелевской премии по химии 2015 года

Шведская Королевская Академия Наук присудила Нобелевскую премию 2015 г. по химии Томасу Линдалю (Tomas Lindahl) из Лаборатории Клэр-Холл Института Френсиса Крика в Хертфордшире (Великобритания), Полу Модричу (Paul Modrich) из Медицинского Института Ховарда Хьюса и Медицинской Школы при Университете Дьюка (США), а также Азиз Санкар (Aziz Sancar) из Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (США) «за исследование механизма восстановления ДНК» [76].

Томас Линдаль. Вехой, отмечающей открытие BER, является выделение урацил-ДНК-гликозилазы Escherichia coli в 1974 г. Томасом Линдалем. Было ясно, что случайно попадающий в ДНК урацил (или образующийся в результате дезаминирования цитозина) должен как-то из неё элиминироваться. Линдаль искал ответственный за это фермент. Неожиданно для исследователей, это оказалась не эндонуклеаза, а фермент, расчленяющий связь между урацилом и рибозой – урацил-ДНК-гликозилаза. Линдаль предположил, что образующийся в результате участок, лишенный пуринового либо пиримидинового основания (AP-сайт) в дальнейшем должен проходить последовательную обработку AP-эндонуклеазой, экзонуклеазой, ДНК-полимеразой и лигазой. Таким образом, уже в самой первой статье были обрисованы основные этапы BER [59]. Первоначально Линдаль изучал нестабильность человеческой ДНК. Ему удалось охарактеризовать и количественно оценить эндогенные повреждения ДНК в работах 1970-80 гг. Исследуя открытый им процесс BER, он выделил несколько ключевых для этого процесса ферментов и описал короткозаплаточный и длиннозаплаточный механизмы BER [61, 76].

Пол Модрич. П. Модрич обнаружил в клетках механизм репарации, который исправляет неправильно спаренные основания. Сейчас этот механизм известен как репарация неспаренных оснований. Он первым установил репарацию мисмэтчей у бактерий: бактерии исправляли неправильно встроенные основания, введенные в ДНК вирусами, поражавшими бактерии. Впоследствии Модрич воссоздал и изучил процесс MMR in vitro и предположил, что этот вид репарации может исправлять 99,9 % таких ошибок, возникающих в ДНК человека во время репликации.

Его открытие стало важной вехой в исследованиях ДНК, связанной с заболеваниями человека. Например, известно, что врожденные дефекты белков MMR могут привести к наследственным вариантам рака толстой кишки. В течение нескольких лет исследования Модрича были сосредоточены на понимании того, как клетки репарируют мисмэтчи в ДНК. В серии исследований он показал, что репаративные ферменты бактерий различают неметилированные участки ДНК для различения материнской и дочерней нити. В 1989 году он описал систему репарации, состоящую из ДНК-полимеразы III, экзонуклеазы I и ДНК-лигазы, которые могли восстановить мисмэтчи ДНК in vitro.

Азиз Санкар. Санкар открыл процесс, при котором клетки восстанавливают поврежденную УФ ДНК, удаляя весь нуклеотид, а не только поврежденное основание [95]. Он показал, что экзонуклеазы вырезают поврежденную часть ДНК размером около 12 нуклеотидов. Завершается этот процесс активацией ДНК-полимеразы, которая заполняет образовавшуюся брешь, а ДНК-лигазы сшивают отрезки цепи ДНК. У бактерий ремонт таких повреждений осуществляют фотолиазы, которые активируются видимым светом. Как обнаружил Сакнар, в клетках млекопитающих сформированные под влиянием УФ димеры в ДНК исправляются в темноте [76].

В целом, результаты работы трех ученых, Томаса Линдаля, Пола Модрича и Азиза Санкара, полностью изменили представление о стабильности, повреждениях и репарации ДНК. Эта информация стала базой для последующих исследований о роли дефектов белков репарации в возникновении ряда заболеваний.

Некоторые заболевания, вызванные дефектами белков эксцизионной репарации

Дефицит или дефекты белков системы эксцизионной репарации приводят к возникновению у человека ряда наследственных, врожденных и приобретенных заболеваний.

Активные формы кислорода (АФК) являются побочным продуктом клеточного дыхания, повреждают ДНК. Механизм BER участвует в удалении окисленных оснований ДНК в ядрах и митохондриях. Таким образом, дефицит белков BER приводит к повышению уровня повреждения ДНК активными формами кислорода и участвует в развитии многих заболеваний человека, в том числе преждевременного старения, нейродегенерации, рака и др. [5, 9, 48, 55, 64].

Неэффективность работы MMR может привести к возникновению наследственной формы неполипозного рака толстой кишки (ННПРТК), или синдрома Линча. ННПРТК составляет около 20 % всех случаев спорадического колоректального рака. Этот вид рака является следствием накопления большого количества небольших вставок или делеций по всему геному. До двух третей случаев возникновения ННПРТК является следствием мутации генов, кодирующих MSH2 и MLH1. На сегодняшний день обнаружено более 70 различных мутаций генов репарации ДНК приводящих к развитию ННПРТК [6, 42, 87, 88].

Система эксцизионной репарации нуклеотидов была подробно изучена благодаря обнаружению у человека связанных с ней трех фенотипически разрозненных генетических заболеваний. Обширная симптоматика этих заболеваний отражает многочисленные биохимические дефекты, вызванные мутациями. Мутации белков, участвующих в NER, приводят к развитию пигментной ксеродермы, синдрому Коккейна и трихотиодистрофии. Эти заболевания дали названия некоторым группам ферментов, реализующим эксцизионную репарацию нуклеотидов: XP – xeroderma pigmentosum, TTD – trichothiodystrophy, CS – Cockayne syndrome [12, 27].

Пигментная ксеродерма. Больные ХР имеют крайне выраженную чувствительность кожи к ультрафиолетовому излучению и 1000-кратное увеличение риска развития рака кожи. Кроме того, у таких больных наблюдается от 10 до 20-кратное увеличение риска развития нескольких видов рака внутренних органов в возрасте до 20 лет, средний возраст появления первой опухоли у больных ХР – 8 лет. Нередки нейрологические аномалии. Может быть вызвана мутациями в генах, кодирующих любой белок группы XP, от XPA до XPG [7, 51].

Трихотиодистрофия. Аутосомно-рецессивное заболевание, основным симптомом которого является специфическая ломкость волос, проявляющаяся в чередовании светлых и темных полос на волосе при микроскопическом исследовании, а также повышенная чувствительность кожи. Нередко сопровождается психической и умственной отсталостью. Вызывается мутациями в генах XPB и XPD [103].

Синдром Коккейна. Болезнь представляет собой задержку роста и развития, приводящую к карликовости, диспропорции конечностей, глухоте, психической и умственной отсталости и ускоренному старению, но не связанную с повышением числа опухолей. Пациенты обычно не переживают возраста 12 лет. Может вызываться мутациями в генах XPB, XPD и XPG, а также CSA и CSB [66, 112].

Весь комплекс систем репарации ДНК связан в единую сеть с ферментативными механизмами репликации ДНК, транскрипции, управления клеточным циклом, апоптозом. Отказ любой из этих систем способен приводить к мутациям и раковым заболеваниям. Судя по всему, существующий на сегодня список генов, участвующих в процессах репарации, далёк от полноты. Дальнейшая идентификация таких генов и уточнение репаративных механизмов не только будут важны для понимания жизнедеятельности клетки, но и сыграют роль в совершенствовании путей предотвращения рака и борьбе с другими заболеваниями.

Источник