Что такое секвенирование в генетике

Секвенирование генома. С чего все начиналось?

Предпосылками для формирования генетики как самостоятельной научной области послужило открытие законов Менделя. В дальнейшем в XX веке было сделано четыре открытия, положивших начало развитию генетики [1]:
• установлены клеточные основы наследственности — хромосомы;
• определена молекулярная основа наследственности — двойная спираль ДНК;
• открыта информационная основа наследственности, а также биологический механизм, с помощью которого клетки считывают информацию, содержащуюся в генах;
• изобретены технологии клонирования и секвенирования рекомбинантных ДНК.

Последняя четверть прошлого века была отмечена неустанным стремлением расшифровать сначала гены, а затем и целые геномы [2].

Первая рабочая концепция секвенирования — метод Сэнгера, также известный как метод обрыва цепи, — была предложена в 1977 году. За это открытие Фредерик Сэнгер был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году. Этот метод секвенирования применялся в течение 40 лет, а его усовершенствование и коммерциализация привели к широкому распространению секвенирования [2].

Описание метода Сэнгера

Секвенирование Сэнгера — метод, при котором используются олигонуклеотидные праймеры для поиска определенных областей ДНК. Этот процесс начинается с деспирализации двухцепочечной ДНК [5]. Одна цепочка ДНК является матрицей для синтеза комплементарной цепочки при помощи фермента ДНК-полимеразы. Реакцию с одной и той же цепочкой проводят в четырех разных пробирках, каждая из которых содержит [3]:
— праймер;
— четыре дезоксинуклеотида (дезоксиаденозинтрифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат, дезоксицитидинтрифосфат и тимидинтрифосфат);
— небольшое количество (1 к 100) одного из радиоактивно меченных дезоксинуклеотидов (для визуализации продуктов реакции).

В каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, заканчивающихся одним и тем же нуклеотидом. После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и затем проводят авторадиографию гелей. Каждый дезоксинуклеотид отмечен флуоресцентным маркером: A — зеленый цвет, T — красный, G — черный и C — синий. Лазер в автомате, используемый для считывания последовательности, фиксирует интенсивность флуоресценции. Когда в последовательности встречается гетерозиготный вариант, локусы захватываются двумя флуоресцентными красителями одинаковой интенсивности. Если присутствует гомозиготный вариант, ожидаемый флуоресцентный цвет заменяется цветом комплементарного основания [5].

Продукты четырех реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в формат ДНК с помощью обратной транскрипции [3].

Секвенирование Сэнгера — это надежный метод для определения генных мутаций, который широко использовался в течение нескольких десятилетий. Метод Сэнгера является геноспецифичным, и с его помощью анализируют небольшое подмножество генов. Секвенирование Сэнгера позволяет идентифицировать мозаичные мутации. Но метод секвенирования Сэнгера не позволяет проводить точную количественную оценку, то есть нельзя сделать вывод о том, в каком количестве клеток есть мутация [5].

Метод дробовика

Метод дробовика используется для секвенирования длинных участков ДНК. Суть метода состоит в получении случайной массированной выборки клонированных фрагментов ДНК данного организма, на основе которых восстанавливается исходная последовательность ДНК [6].

Первые методы секвенирования способны восстанавливать небольшие последовательности ДНК (порядка 1000 нуклеотидов), следовательно, для секвенирования более длинных последовательностей требовалось разработать новый подход. При секвенировании методом дробовика ДНК случайным образом фрагментируется на мелкие участки с помощью сайт-неспецифичных нуклеаз. Затем фрагменты секвенируют любым доступным методом, например, методом секвенирования по Сэнгеру. Полученные перекрывающиеся случайные фрагменты ДНК собирают с помощью специального программного обеспечения в одну целую последовательность. Данный метод оставался фундаментальным методом секвенирования генома в течение 20 лет [2]. В 1981 году метод применен на практике — полное секвенирование генома вируса мозаики цветной капусты [7].

На практике трудности возникают из-за повторяющихся последовательностей. Например, можно легко секвенировать типичные бактериальные геномы (около 1,5 % повторов) или эухроматическую часть генома мухи (около 3 % повторов). Человеческий геном содержит более чем 50 % повторяющихся последовательностей. Такие особенности усложняют сборку правильной и законченной последовательности генома [2].

В дальнейшем этот подход совершенствовался: были улучшены механизмы фрагментации и клонирования ДНК. В 1990 году был предложен метод секвенирования парных прочтений. Результаты первого применения метода секвенирования парных концов на практике были опубликованы в 1990 году в работе, посвященной секвенированию человеческого гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы [4].

При секвенировании парных прочтений ДНК разрезается на случайные фрагменты, которые затем группируются по весу и клонируются в векторах. Клоны секвенируют с обоих концов с использованием метода обрыва цепи, в результате которого образуются две коротких последовательности [4].

Иерархическое секвенирование методом дробовика

Для секвенирования больших геномов, содержащих повторяющиеся последовательности, используется подход «иерархического секвенирования методом дробовика» [2].

Данный метод — технически более сложный из-за необходимости обработки больших объемов данных. Это служит причиной тому, что метод иерархического секвенирования имеет более высокую стоимость [2].

Переломной точкой развития методов секвенирования стало появление и широкое распространение технологий ПЦР, автоматизация этапов «чтения» ДНК, совершенствование программного обеспечения. Все это дало начало созданию методов секвенирования следующего поколения. Секвенаторы нового поколения значительно дешевле и гораздо эффективнее своих предшественников. На сегодняшний день производительность некоторых секвенаторов измеряется уже сотнями миллиардов пар оснований, что, например, позволяет подобным приборам сканировать индивидуальный геном человека всего за несколько дней.

Источники:

Источник

Что такое секвенирование в генетике

Сегодня много пациентов страдает от неверного диагноза или несвоевременно обнаруженного заболевания, связанного с нарушениями в структуре ДНК.

Распространенные генетические тесты, такие как анализ одного гена, панели из нескольких генов или микроматричный анализ, часто не могут до конца выявить точную причину болезни из-за своих ограниченных возможностей.

Недавние достижения молекулярной генетики позволили сделать доступным по цене и скорости выполнения новый метод генетического тестирования — полногеномное секвенирование.

Полное секвенирование генома способно обнаружить почти все изменения в ДНК пациента, расшифровывая последовательность всех кодирующих и некодирующих областей. Результат такого исследования — информация о тысячах генов, участвующих в нормальном росте и развитии организма.

Этот метод с успехом заменяет все ранее известные способы генетического тестирования, соединяя в себе их возможности. С каждым годом он позволяет установить точный диагноз все большего числа заболеваний.

Используя полногеномное секвенирование, лечащий врач получает помощь не только в диагностике, но и более точно принимает решения по лечению, может наблюдать за течением заболевания, делать прогноз развития болезни и выздоровления. Точные рекомендации о прогрессировании заболевания также возможны в некоторых случаях.

По результатам тестирования может быть проведена оценка риска наследственных заболеваний для других членов семьи.

Полное секвенирование может быть проведено по направлению лечащего врача, а также по желанию пациента без наличия срочных медицинских показаний.

Структура генома не изменяется в течение всей жизни. Сделав анализ однократно, его результатами можно пользоваться всю жизнь. К ним можно повторно обращаться при появлении очередных открытий в генетике и с учетом новых знаний более точно интерпретировать данные.

Имея на руках готовую расшифровку своего генотипа, человек подготовит себя к возможным экстренным ситуациям, когда подробная генетическая информация может спасти жизнь — травмы, операции, тяжелые заболевания, пересадка органов и другие.

Полногеномное секвенирование — лучший на сегодня метод продолжать исследование структуры ДНК, функций генов, их влияния друг на друга и на проявления фенотипа.

Хотя крупные исследовательские центры в мире ведут эту работу, ее результаты не всегда широко доступны.

Поэтому многие исследователи делают это самостоятельно для своих узкоспециализированных целей — подбор и разработка препаратов, спортивные достижения, селекция растений и животных, диагностика и лечение болезней.

Лаборатория «Геномед», обладая современным оборудованием, проверенными технологиями и квалифицированными специалистами-генетиками, готова предоставлять эти ресурсы для целого ряда научных разработок.

Фундаментальные исследования

Изучение структуры и функции генома

Исследование генома человека не завершено до сих пор. Полногеномное сенквенирование дает новые возможности поиска нераскрытых функций генов, изучения некодирующих областей и регуляторных участков ДНК.

Структурные изменения и CNV

В отличие от большинства других генетических методов полногеномное секвенирование позволяет точно определять любые изменения структуры ДНК.

Часто достигается точность определения до уровня единичного нуклеотида. Поэтому, если требуется достоверно определить транслокации, инверсии, вставки или делеции участков, стоит использовать тест Genome UNI.

Эпигенетика

После создания технологии полногеномного секвенирования появилась возможность изучать закономерности наследования, не связанные с генетической последовательностью. В первую очередь речь идет о механизмах регуляции экспрессии генов.

В вопросах эпигенетики важную роль играют методики исследования метилирования ДНК (MeDIP-Seq, WGBS), взаимодействия и модификации гистонов (ChlP-Seq), метилирования РНК (TRM).

Полногеномные ассоциативные исследования

Исследование связи между структурой генома и фенотипическими признаками позволяет выявить, как проявляются различные сочетания генов.

Результат такой работы — более четкое понимание механизмов развития полигенных и многофакторных заболеваний, выявление влияния гетерозиготности на развитие признаков и оценка влияния средовых факторов.

Митохондриальный геном

В отличие от других генетических тестов полногеномное секвенирование исследует одновременно весь генетический материал клетки — ДНК ядра и ДНК митохондрий. Это особенно важно при изучении наследственности по материнской линии и обнаружении наследственных митохондриальных заболеваний.

Транскриптом

Полногеномное секвенирование позволяет оценивать не только геном клетки, но и ее транскриптом — совокупность всех типов РНК.

Важность транскриптома в том, что он показывает активность экспрессии определенных генов на текущий момент. Эта активность сильно зависит от состояния окружающей среды и самого организма и может говорить о наличии неблагоприятных процессов.

Биоинформатический анализ

Расширенный пайплайн

Многопотоковое секвенирование позволяет одновременно проводить расшифровку множества участков одной ДНК. Это значительно ускоряет процесс чтения, позволяет снизить стоимость и добиться высокой точности.

В настоящее время полногеномный анализ покрывает больше 96% генов с глубиной прочтения >20х, а время исследования одного генома сократилось до 1 суток.

Платформа управления данными

Результаты анализов представлены в виде удобного пользовательского интерфейса в личном кабинете. Там же доступны данные интерпретации, если она проводилась, и полученные рекомендации.

Владелец доступа может в любое время обратиться к своим результатам или загрузить их для off-line использования.

Пользовательский биоинформационный сервис

Кроме оборудования и передовых технологий «Геномед» рад предоставить консультационные услуги опытных врачей-генетиков.

Направляя пациента на анализ, вы получите не только расшифровку нуклеотидной последовательности, но и, при необходимости, ее клиническую интерпретацию и рекомендации по использованию результатов.

Собственное хранилище данных

Данные о проведенных исследованиях хранятся на собственных серверах лаборатории.

Все данные шифруются и доступ к ним предоставляется исключительно заказчику с индивидуальным логином и паролем.

Прикладные исследования

Диагностика генетических заболеваний

Сегодня насчитывают около 6000 различных генетических заболеваний и нарушений. Многие из них обладают схожими симптомами, но вызваны патологией разных генов. Если искать эти заболевания по отдельности, потребуется огромное количество исследований.

Полногеномное секвенирование позволяет заменить все виды генетических и многих лабораторных исследований единственным точным и высокоинформативным тестом.

Геном опухоли

Полногеномное секвенирование опухоли дает ключ к пониманию канцерогенеза. Это не только определение основных мутаций, приводящих к развитию рака.

Получив полную расшифровку генома, онколог может оценить уровень сопротивляемости организма росту опухоли, следить за изменением опухоли под воздействием терапии, подбирать наиболее эффективные и безопасные сочетания препаратов.

Профилактическое здоровье

Данные об индивидуальных предрасположенностях к заболеваниям могут изменить образ жизни человека.

На этом основании проще подобрать диету, нагрузки, препятствовать или способствовать воздействию различных факторов внешней среды.

Это позволит не просто увеличить продолжительность жизни, но и улучшить ее качество.

Создание лекарств

Данные об индивидуальных предрасположенностях к заболеваниям могут изменить образ жизни человека.

В зависимости от своего генетического статуса человек по разному реагирует на лекарственную терапию. Гены влияют как на эффективность, так и на переносимость препаратов. Полногеномное тестирование позволяет решать две важные задачи фармакотерапии.

Первая задача — поиск биомаркеров заболеваний. Наглядный пример — простатоспецифический антиген, используемый для диагностики опухолей предстательной железы.

Вторая задача — персонализация лекарственной терапии. В идеале препарат должен разрабатываться для генотипически близких групп пациентов или даже индивидуально с учетом конкретного набора генов.

Судебная медицина / Судебная патология

Генетические данные сегодня широко используются в криминалистической и судебной практике. Ниже перечислены некоторые примеры такого применения. Определение родства\материнства\отцовства.

Антропология и этнос

Изучение ДНК предков или представителей различных этнических групп позволяет понимать историю происхождения и развития человека и законы передачи наследственной информации.

Для отдельного человека появляется возможность разобраться в своих корнях и родословной. Для общества и науки — это источник изучения этнических особенностей здоровья, заболеваемости, долголетия и возможностей развития.

Диагностика наследственных заболеваний

Анализ всего генома в одном исследовании чаще всего приводит к более быстрой постановке диагноза генетического состояния по сравнению с многочисленными сериями одиночных генетических тестов. Особенно это справедливо, если клиническая картина не дает генетику четких указаний, в каких локализациях следует искать патологию, либо тогда, когда клиника может быть обусловлена патологией разных или нескольких генов.

Репродуктивное здоровье

Четко определена связь ряда генов с репродуктивной функцией. Мужское и женское бесплодие, невынашивание, хромосомные болезни новорожденных — все эти состояния можно обнаружить, а впоследствии и успешно лечить, если знать состояние генов, ответственных за процессы зачатия и развития плода.

Онкология

Молекулярно-генетические исследования — мощный инструмент в борьбе с онкологическими заболеваниями.

Во-первых, расшифровав полный геном, можно оценить не только гены, напрямую связанные с развитием рака. Одновременно врач получает полную картину состояния антиоксидантной защиты, противоопухолевого иммунитета, антитоксической функции и других систем, которые косвенно влияют на появление и течение онкопроцесса.

Во-вторых, генетические методы позволяют более эффективно подобрать препарат, контролировать процесс лечения и склонность к рецидивированию.

Важно, что полногеномное исследование (WGS) экономически намного выгоднее, чем исследование отдельных генов или серии генетических панелей (наборов анализов генов, связанных с определенной патологией).

Сегодня с помощью полногеномного тестирования можно оценить 649 опухолевых генов и еще 28 генов, способных нести хромосомные транслокации (перенос участков ДНК между хромосомами), связанные с развитием рака.

Планирование семьи

Известно, что предрасположенность к заболеваниям передается по наследству. Существует группа заболеваний, которые зависят от состояния генов и носят название аутосомно-рецессивных.

Полногеномное секвенирование способно показать людям, вступающим в брак, риски рождения у них детей с аутосомно-рецессивными болезнями.

Предрасположенность к заболеваниям

Почему одни люди заболевают раком, а другие нет? Кто-то живет до 100 лет, многие же умирают в молодости. Как узнать причину?

Сегодня уже четко установлена связь многих генов с развитием заболеваний. Причем, состояние одних генов улучшает прогноз, других — ухудшает. Примеры таких болезней — атеросклероз, остеопороз, тромбозы.

Если знать сочетание всех генов, можно рассчитывать риск развития заболеваний для человека, даже если он пока абсолютно здоров, а также предотвращать их появление.

Индивидуальные способности

Для многих способностей и склонностей человека показана прямая зависимость от состояния его генотипа. К ним относятся мышечная выносливость и сила, темперамент, наклонность к разного рода зависимостям и многое другое. Если планировать профессию и образ жизни на основании генетического анализа, можно достигать лучших результатов быстрее и с меньшими усилиями.

Почему нужно использовать
секвенирование генома

Полногеномное тестирование обладает целым рядом преимуществперед другими методами
в скорости, широте и точности расшифровки генетической последовательности
и установлении диагноза.

Информация для исследователей

Фундаментальные исследования

Секвенирование и ресеквенирование генома, анализ метагенома, экспрессии и метилирования генов.

Прикладные исследования

Поиск биомаркеров, рекрутинг пациентов, решения для селекции.

Медицинские исследования

Секвенирование генома и экзома, анализ на микрочипах.

Биоинформатический анализ

Расширенный пайплайн, биоинформационный сервис, платформа управления данными, хранилище данных.

Genome UNI рекомендован:

Врачам на заметку!
Genome UNI выявит:

Обладает ли тест Genome UNI
доказанной эффективностью?

Для анализа данных используется проприетарный алгоритм и пайплайн, разработанный одной из ведущих компаний США, которая специализируется на анализе данных полного секвенирования генома.

Пайплайн разработан в соответствии с требованиями профессиональной ассоциации медицинских генетиков (ACMG) и ассоциации клинических патологов (CAP) США и включает возможность анализа данных с учетом формализованного описания фенотипа в терминах HPO.

Строгий подход к оценке качества лабораторных данных при использовании профессионального пайплайна позволяет не только повысить выявляемость вариантов, но и избежать ошибок которые могут возникнуть на стадии сиквенса и снизить вероятность ложноположительных результатов.

WGS выявляет больше инсерцционно-
делеционных вариантов при 30х чем WES
при средней глубине 100х

WGS охватывает больше генов на при 30х,
чем WES при 100х

Источник

Одноклеточное секвенирование: разделяй, изучай и властвуй

Одноклеточное секвенирование: разделяй, изучай и властвуй

Одноклеточное секвенирование дает возможность увидеть более детальную картинку. Рисунок в полном размере.

Автор

Редакторы

Современные методы полногеномного секвенирования позволяют считывать миллиарды последовательностей нуклеиновых кислот (НК) — ДНК или РНК — за считанные часы. Человечество вплотную подобралось к пониманию механизмов реализации генетического материала в живых системах, и новые технологии одноклеточного секвенирования с возможностью визуализации пространственного положения нуклеиновых кислот внутри или вне клетки, похоже, стали еще одним шагом к этой цели.

Ультрасовременные методы

Методы, которыми оперирует современная наука, постоянно совершенствуются. Некоторые области развиваются настолько стремительно, что порой даже специалистам сложно уследить за новейшими приборами и модификациями методик. Так происходит, например, в геномике. Другие же области (такие как гистология и связанные с ней световая и флуоресцентная микроскопия) развиваются куда медленнее, но всё равно расширяются и обзаводятся более высокопроизводительными методами. В статьях нового спецпроекта (он продолжает наш хит — «12 биологических методов в картинках») мы хотим рассказать, какие методы помогают ученым совершать новые открытия сегодня, и чего нам ждать в будущем.

Партнер этой статьи — «СкайДжин».
Пять причин выбрать SkyGen:

К середине прошлого столетия, в момент открытия нуклеиновых кислот (НК — ДНК и РНК) как носителей генетической информации живых организмов, перед исследователями встал вопрос о возможности прочтения их последовательности — секвенирования. Десятки лет и поступательный прогресс во многих отраслях науки и инженерии сделали возможным сначала определение последовательности отдельных фрагментов ДНК, а затем и секвенирование целых геномов.

К настоящему времени разработано и выведено на биотехнологический рынок значительное количество методов секвенирования НК. Самый популярный и надежный из них — секвенирование методом «терминаторов» — разработал британский биолог Фредерик Сэнгер с коллегами в далеком 1977 году [1]. За десятки лет данный метод неоднократно модифицировался (например, радиоактивные метки заменили флуоресцентными), однако идея, лежащая в его основе, не изменилась. Анализируемый, предварительно многократно амплифицированный фрагмент ДНК (до 1000 пар нуклеотидов (п.н.) — букв генетического алфавита) используется как матрица для синтеза комплементарной (дочерней) цепочки ферментом ДНК-полимеразой в присутствии дезоксинуклеозидтрифосфатов (А, Т, Г, Ц — аденина, тимина, гуанина и цитозина). Кроме того, в смеси находятся флуоресцентно меченные дидезоксинуклеозидтрифосфаты, которые прерывают реакцию синтеза из-за особенности химического строения. Благодаря флуоресценции и электрофорезу в геле можно точно установить длину конкретного секвенируемого фрагмента ДНК и последнюю букву в нем. Поскольку в реакционной смеси параллельно проходят тысячи реакций, используя этот уже полностью автоматизированный метод, можно восстановить последовательности десятков ДНК-фрагментов.

Несмотря на то, что определение последовательностей НК по Сэнгеру до сих пор является «золотым» стандартом секвенирования и нашло свое применение в различных жизненно важных отраслях (таких как медицинская генетика и криминалистика), его производительность оставляет желать лучшего [2], [3].

Геномы многих растений и позвоночных животных, в том числе и человека, состоят из миллиардов «букв», и определение их полных последовательностей с использованием настолько «олдскульных» методов экономически нецелесообразно.

За последние годы сразу несколько технологий глубокого секвенирования внедрились в современную биологическую науку. Некоторые из них — лигазное секвенирование или пиросеквенирование, о которых можно почитать в нашей обзорной статье «12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот» [2], — уже не поддерживаются их разработчиками, в то время как секвенирование на молекулярных кластерах (также известное как технология Illumina), или одномолекулярное секвенирование в реальном времени (чуть позднее к ним присоединилась технология cPAS секвенирования), прочно заняли свои ниши. Одна часть этих технологий прекрасно подходит для анализа новых, ранее не опубликованных геномов или поиска длинных некодирующих РНК, тогда как другая эффективна и обходится дешевле при ресеквенировании или анализе экспрессии генов. Более того, исследователи могут комбинировать разнообразные методы для достижения наиболее интересных результатов. В частности, одномолекулярное секвенирование — которое осуществляется благодаря приборам PacBio, — также как и нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore) [2], [10], регулярно используется вместе с технологией Illumina для хромосомной сборки новых геномов, в том числе и полиплоидных [11–13].

Одноклеточное секвенирование (ОКС, scRNA-seq)

Таким образом, на сегодняшний день секвенирование ДНК и РНК — это во многом рутинная процедура, которая служит лишь в качестве одного из множества методов современной молекулярной биологии и биотехнологии. Используемые сегодня методы секвенирования НК позволяют оценивать не только последовательность ДНК, но и экспрессию кодируемых ею молекул РНК (транскриптом), а также разнообразные типы модификаций генома и транскриптома, такие как метилирование, тесно связанное с активностью генов. В то же время перед учеными то и дело встают новые задачи. Так, несмотря на генетическую идентичность клеток в одном организме, иногда требуется оценить разницу между одиночными клетками и их субпопуляциями; более того, последние исследования показали, что из ста триллионов клеток, составляющих человеческое тело, не найдется и двух с полностью одинаковым геномом — из-за мутаций, накапливающихся в эмбриогенезе и в течение жизни организма [14].

Дело в том, что большинство широко применяемых методов анализа нуклеиновых кислот позволяет работать с тканями, которые состоят из абсолютно разных клеточных субтипов. При этом, анализируя образцы ДНК или РНК из таких экстрактов, ученые получают некие усредненные результаты и редко могут прицельно дотянуться до конкретной функции или механизма.

В результате исследователи, обращаясь к классическим методам глубокого секвенирования, нередко сталкиваются с трудностями — например, при анализе геномов некультивируемых микроорганизмов, изучении генетического мозаицизма [14] или геномном анализе клеточных субпопуляций раковых опухолей. Связаны эти трудности, как правило, с биоинформатическим анализом данных, а иногда эксперименты вовсе не дают необходимых результатов [15]. Не меньше проблем у ученых до недавнего времени возникало в ходе анализа экспрессии генов или метилирования в комплексных тканях, состоящих из разных типов клеток (например, тканях головного мозга), или в тканях, пронизанных кровеносными сосудами [16], [17].

Ответом на все эти вызовы стали технологии одноклеточного секвенирования (ОКС). Они позволяют получать информацию о многомерности тканей, выявляя различия в клеточных популяциях, и оценивать клеточные взаимосвязи, а не получать лишь среднее значение для многих клеток, теряя информацию об их гетерогенности, как это было раньше. И если еще недавно широкое распространение ОКС сдерживалось его высокой стоимостью, то по мере появления новых методов пробоподготовки и секвенирования сегодня данный подход используется всё чаще [18].

Одноклеточное секвенирование можно разделить на четыре важнейших этапа:

На протяжении всех четырех этапов важно обращать внимание на ряд экспериментальных параметров и критических точек, следование которым позволит провести успешный эксперимент и получить достоверные данные [19].

Пожалуй, одним из важнейших этапов при одноклеточном секвенировании является пробоподготовка, поскольку она может в значительной мере повлиять на результат. Например, ткани с высокими показателями адгезии между клетками должны быть тщательно диссоциированы до одноклеточного уровня. С другой стороны, экспериментатор должен отдавать себе отчет в том, что более разрушительные методы суспендирования клеток могут иметь фатальные последствия для результатов, приводя к гибели части клеток и тем самым нарушая соотношения субпопуляций в ткани. На сегодняшний день для диссоциации тканей используют три основных подхода: ферментативный (обработка биологического образца ферментами, разрушающими межклеточный матрикс, — коллагеназой, эластазой, трипсином и другими), механический (диссекция клеток, пипетирование, центрифугирование и др.), а также комбинированный, который включает в себя первые два.

Кроме того, в некоторых случаях необходима не только диссоциация клеток и приготовление их суспензий, но и «обогащение» редко представленных клеточных субпопуляций в общем клеточном пуле, а также элиминация мертвых клеток. Для этих случаев может быть использована целая плеяда методов, которые позволяют идентифицировать определенную субпопуляцию клеток, основываясь на их массе, размере, плотности. Различные флуоресцентные метки, в свою очередь, применяются для идентификации и последующей сортировки определенных типов клеток [20].

Широкое распространение при подготовке биологических образцов к ОКС получили методы проточной цитофлуориметрии. Проточная цитометрия является ценным инструментом для контроля качества, поскольку с ее помощью одновременно можно оценивать множество показателей, включая размер клеток, их жизнеспособность, а также адгезию между клетками. Подробнее о методах цитометрии можно почитать в ранее опубликованной на «Биомолекуле» статье «12 методов в картинках: проточная цитофлуориметрия» [21].

Chromium Controller: как анализировать множество клеток сразу

Прибор Chromium Controller от компании 10x Genomics способен быстро разделять клетки по отдельным каплям и баркодировать их ДНК, что позволяет проводить параллельный высокопроизводительный анализ десятков тысяч клеток.

Рисунок 1. Схема работы прибора Chromium Controller для секвенирования ДНК отдельных клеток или ядер

Прибор компактен и очень прост в использовании: всё, что требуется пользователю — это правильно загрузить чип и поместить его в прибор. В чип вносят клетки, реагенты (гелевые частицы) и масло (рис. 1).

Весь эксперимент можно разделить на пять этапов:

Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин»

После лизиса из каждой клетки выделяется генетический материал, используемый для приготовления ДНК-библиотек. Поскольку каждая клетка содержит лишь один диплоидный геном, его необходимо предварительно амплифицировать, так как современные платформы для секвенирования не позволяют работать с одной или двумя копиями генома (рис. 2). Для наработки достаточного количества копий при пробоподготовке используют разнообразные методы полногеномной амплификации (whole genome amplification, WGA), позволяющие избежать значительного количества ошибок, — например, изотермическую ПЦР. В случае работы с различными типами РНК пул транскриптов предварительно переводят в комплементарную ДНК (кДНК) при помощи обратной транскриптазы, а затем также амплифицируют отдельно для каждой клетки. В настоящее время особой популярностью по-прежнему пользуется метод амплификации со множественным замещением цепи (multiple displacement amplification, MDA) с применением полимеразы phi29 (выделенной из одноименного бактериофага). Данная полимераза славится своей высокой процессивностью, малым количеством ошибок и широтой покрытия генома (около 84%) [24].

Другой метод полногеномной амплификации, известный под аббревиатурой MALBAC (Multiple annealing and looping-based amplification cycles), объединяет в себе MDA и обычную ПЦР и дает возможность не только амплифицировать значительную часть генома (более 50%) или транскриптома, но и добиться высокой равномерности покрытия и меньшей частоты потери аллелей относительно использования полимеразы phi29 [24] — она предпочтительно амплифицирует один аллель в гетерозиготном состоянии.

Таким образом, MDA и MALBAC имеют как преимущества, так и недостатки, а поэтому должны применяться в зависимости от целей эксперимента.

Рисунок 2. Основные этапы подготовки образцов ДНК и РНК для одноклеточного секвенирования

После выделения и амплификации НК для каждой анализируемой клетки исследователь должен выбрать дальнейшее направление пробоподготовки, которая в будущем определит методику секвенирования. Сегодня на биотехнологическом рынке представлены самые разные технологии определения последовательности НК, способные решать стоящие перед исследователем задачи. Вот главные из них:

Первые четыре технологии подробно рассмотрены ранее на «Биомолекуле» («12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот» [2] и «Нанопоровое секвенирование: на пороге третьей геномной революции» [10]), тогда как технология сPAS, выведенная на рынок коммерческих приборов китайской компанией BGI Genomics, вошла в повседневный обиход лишь несколько лет назад, но уже слегка потеснила технологию массового секвенирования, предлагаемую компанией Illumina.

На примере работы с геномной ДНК суть метода cPAS (рис. 3) заключается в следующем. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК (около 500 пар оснований) лигируют адаптеры. Затем полученную библиотеку циркуляризируют и амплифицируют, используя ранее упомянутый метод с множественным замещением цепи (MDA) по принципу катящегося кольца, то есть исходный фрагмент прочитывается многократно. Такой подход позволяет избежать клонального накопления ошибок полимеразы. После того, как количество амплифицированных фрагментов достигнет нескольких сотен, они укладываются с использованием запатентованной технологии в ДНК-наношарик (DNA nanoball, DNB) [25].

Рисунок 3. Технология cPAS-секвенирования. Фрагментированная геномная ДНК лигируется с четырьмя адаптерами, формируя кольцевую ДНК-библиотеку. ДНК-наношарик формируется путем репликации по принципу катящегося кольца. Каждый ДНК-наношарик помещается в определенное место на ячейке секвенатора. Считывание ДНК осуществляется с использованием принципов гибридизации и лигазного секвенирования.

Полученные ДНК-фрагменты, компактизированные в виде ДНК-наношариков, наносятся на проточную ячейку секвенатора, где закрепляются за счет электростатических сил. На проточной ячейке проводят циклический процесс секвенирования, в котором объединяются принципы гибридизации и лигазного секвенирования. Реакционная смесь для синтеза комплементарной ДНК подается на поверхность проточной ячейки и содержит ферменты, а также четыре типа флуоресцентно меченых проб, состоящих из нуклеотидов универсальной специфичности (способных связаться с любым из нуклеотидов матричной ДНК), а также одного известного нуклеотида (A, T, G или С) на 5′-конце. После гибридизации пробы и специфичного нуклеотида лигирования по 5′-концу камерой с ПЗС-матрицей считывается флуоресценция пробы, а затем универсальные нуклеотиды и флуоресцентный краситель смываются. Эта серия шагов продолжается определенное количество раз, число которых задает пользователь [25].

Биоинформатический анализ данных одноклеточного секвенирования

Биоинформатический анализ данных одноклеточного секвенирования, несмотря на идеологическое сходство с классическим, рутинным анализом транскриптома в тканях и клеточных культурах (подробная информация представлена в классическом обзоре: A survey of best practices for RNA-seq data analysis [26]), представляет собой не самую тривиальную часть эксперимента, и в рамках данного обзора крайне сложно пройтись по всем подводным камням, которые ожидают компьютерного биолога. Уж слишком много приложений одноклеточного секвенирования существует сейчас, да и каждое конкретное исследование, ткань или модель требуют особого подхода.

Важный момент при анализе данных одноклеточного секвенирования — необходимость нормализации изучаемых образцов. Дело в том, что в ходе экспериментальных процедур (сепарация клеток, выделение НК, полногеномная амплификация и создание библиотек) существует значительная вероятность ошибок. Эти, казалось бы, незначительные этапы в дальнейшем могут существенно влиять на ширину и глубину покрытия генома/транскриптома, на смещение в числе определенных типов клеток и их субпопуляций, а также на соотношение аллелей. Данные проблемы решаются воспроизводимостью экспериментальных процедур, добавлением технических и биологических повторностей, а также использованием дополнительных математических методов [19].

При геномном секвенировании глубина покрытия отдельных клеток значительно меньше, чем в массовых экспериментах. Таким образом, увеличение разрешения до клеточного уровня с использованием технологий ОКС означает также снижение достоверности обнаруживаемых механизмов, которые становятся более стабильными, когда суммируются (например, при анализе ткани). В конечном счете, задачи, которые ранее казались рутинными (например, поиск единичных нуклеотидных вариаций или геномных перестроек в субпопуляциях опухоли), требуют значительной методологической осторожности при обращении с данными одноклеточного секвенирования [27].

Так же как и при геномном секвенировании, анализ транскриптомных данных ОКС теоритически позволяет получить полное представление о взаимодействии транскриптов внутри отдельных клеток. Однако анализ экспрессии генов единичных клеток зачастую страдает от недостаточного покрытия, что в результате объединяет два различных типа нулевых значений в экспрессии конкретного транскрипта:

Во многом результаты транскриптомных исследований на одноклеточном уровне (впрочем, как и геномных) напрямую зависят от лабораторной части эксперимента, используемой платформы для пробоподготовки и секвенирования, глубины секвенирования, уровня экспрессии конкретного гена и так далее [27].

Подводя итог, можно сказать, что одноклеточное секвенирование НК может выявить сложные и редкие популяции клеток, найти регуляторные взаимосвязи между генами и отследить траектории развития отдельных клеточных линий. Дальнейшие технические усовершенствования на уровне молекулярной и клеточной биологии и доступных биоинформатических инструментов значительно облегчат как фундаментальные исследования, так и прикладное применение (медицина и биотехнология) этих технологий секвенирования [19].

Пространственная транскриптомика: новый шаг вглубь клетки и её машинерии

Распознавание пространственно-временных паттернов экспрессии генов имеет решающее значение для понимания основных биологических принципов от эмбриогенеза до возникновения и протекания болезней. Новые методы пространственной транскриптомики в единичных клетках расширяют наши знания о молекулярных процессах, протекающих внутри клеток и во внеклеточной среде. Эти подходы позволяют, например, реконструировать в цифровом виде паттерны эмбриональной экспрессии в 3D и успешно идентифицировать новые домены экспрессии, типы клеток и особенности тканей. Такие технологии открывают путь к беспристрастному и исчерпывающему анализу уровней экспрессии генов в пространственном и количественном выражении, способствуют пониманию функционирования генома и эпигенома в клетке.

Подробнее о роли микроокружения в прогрессировании онкологических заболеваний можно почитать здесь: «Опухолевые разговоры, или Роль микроокружения в развитии рака» [22].

Современные методы молекулярной биологии, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и микроскопии позволили не только анализировать синтез молекул РНК из отдельных тканей или отдельных клеток, но и визуализировать их в живых системах. Подобная визуализация in vivo может быть осуществлена посредством гибридизации меченого зонда, комплементарного транскриптам-мишеням. Более того, современные системы считывания анализа флуоресценции (например, сложные зонды, использующие комбинации флуорофоров) позволяют избегать спектрального перекрытия различных меток и тем самым анализировать значительное количество мишеней в клетке. В то же время этот подход не подходит для идентификации положения всех транскриптов в клетке [31].

Общей проблемой методов, основанных на FISH, считается их высокая цена и связанная с ней ограниченность в выборе транскриптов, а также высокий уровень фона аутофлуоресценции в непрозрачных образцах тканей [30].

Методы флуоресцентной гибридизации in situ, как показала практика, имеют существенные ограничения по числу реализующихся транскриптов, которые возможно описать. Поэтому были предложены другие методы, основанные на идентификации положения транскриптов в клетке, их захвата и последующего секвенирования ex situ. Такая концепция реализована в нескольких методологических подходах, где возможен анализ всего транскриптома. Однако основным препятствием для продвижения этих методов долгое время являлась ограниченная эффективность захвата РНК, которая становится всё более сложной при более высоком разрешении.

Первый способ пространственной транскриптомики был опубликован в 2016 году и в настоящее время коммерциализирован компанией 10x Genomics под названием 10x Visium. Суть данной методики заключается в приготовлении тонких (10–50 мкм) гистологических срезов и нанесении их на специальные предметные стекла с иммобилизованными на них поли-dT-олигонуклеотидами, для каждого из которых известно местоположение по Х- и Y-осям, и каждый из которых имеет специфический баркод. В дальнейшем ткань фиксируется, окрашивается и визуализируется (рис. 4).

Рисунок 4. Пример использования пространственной транскриптомики при анализе экспрессии генов в тканях префронтальной коры головного мозга человека. С помощью набора реагентов для пермеабилизации происходит снижение проницаемости клеточных мембран, и информационные РНК (матричные РНК, мРНК) диффундируют вниз к твердой поверхности слайда, локально гибридизуясь с иммобилизованными на его поверхности поли-dT-олигонуклеотидами. Затем методом обратной транскрипции проводится синтез кДНК и другие этапы подготовки библиотеки для последующего секвенирования с использованием одной из популярных платформ. Данные в дальнейшем экстраполируются на изображение среза ткани, полученное в начале эксперимента, предоставляя тем самым информацию о расположении конкретного транскрипта в клетке [32].

Области применения технологий single cell sequencing от компании 10x Genomics

Анализ уровня экспрессии единичных клеток, как и анализ пространственной экспрессии генов, может применяться для исследований в различных областях, включая:

Нейробиология

Нервная система — это сложная сеть, состоящая из различных типов клеток, которые имеют множество сигнальных путей и синаптических взаимодействий. При нарушении функций или взаимодействий компонентов центральной нервной системы (ЦНС) возникают нейродегенеративные заболевания, причем их причиной может послужить как травма, так и заболевание или генетическая вариативность (рис. 5).

Рисунок 5. Нейробиология — широкое поле для исследований

Традиционные методы изучения клеточных типов и подтипов в нервной ткани — это иммуногистохимия, гибридизация in situ, анализ на микрочипах. Эти технологии основаны на детекции небольшого количества известных мишеней, таких как клеточные маркеры, миелинизированные аксоны или амилоидные бляшки, и требуют большого количества образца для анализа. Также эти методы не могут предоставить информацию о гетерогенности клеточных субтипов и их уровней экспрессии.

В то же время анализ на уровне единичных клеток позволяет:

Онкология

Несмотря на огромное количество исследований в области онкологии, у ученых всё еще остается множество вопросов. Какие механизмы лежат в основе возникновения и прогрессии опухоли? Как различная реакция на терапию может быть применена к разным пациентам с различными типами опухолей? Как идет метастазирование в зависимости от типа опухоли и особенностей больного? Ответить на эти и многие другие вопросы может анализ на уровне единичных клеток. 10x Genomics разработала ряд готовых протоколов для различных задач:

Иммунология

На фронте многих важных научных и медицинских достижений находятся исследования в области иммунологии, такие как профилирование новых патогенов, разработка вакцин, разработка иммуноонкологических методов лечения, изучение аутоиммунных заболеваний, подбор тканей для безопасной трансплантации органов и многое другое. Область действительно масштабная по своим направлениям, ниже представлены некоторые из них с точки зрения анализа на уровне единичных клеток:

Инфекционные заболевания. Узнайте, как патогены заражают клетки-хозяева и вызывают иммунные реакции. Свяжите иммунный ответ хозяина с выздоровлением или тяжестью инфекции.

Аутоиммунные реакции. Расшифруйте основные механизмы неправильно направленных иммунных реакций. Исследуйте патофизиологию заболеваний в отдельных клетках и системах органов.

Трансплантология. Контролируйте клиническое ведение трансплантации органов или гематологических стволовых клеток. Изучите иммунологическую основу заболеваний, связанных с трансплантацией.

Поиск новых лекарств. Определите репертуар рецепторов и антигенную специфичность адаптивных иммунных клеток. Ведите разработку вакцин, выявляйте профилактические антитела и проводите целенаправленную иммунотерапию.

Клеточная и молекулярная иммунология. Ведите фундаментальные исследования иммунной системы в области здоровья и болезней. Характеризуйте разнообразие, функции и организацию иммунных клеток в организме.

Аллергии и воспаление. Исследуйте особенности врожденной и адаптивной иммунной активации. Расшифруйте механизмы иммунной гиперактивации в ответ на аллерген или травму.

Иммуноонкология. Определите инфильтрирующие иммунные клетки в микроокружении опухоли. Охарактеризуйте функции иммунных клеток и репертуар рецепторов.

Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин»

Кроме описанного выше, существуют и другие методы пространственного секвенирования. Один из них (Slide-Seq) использует магнитные шарики с иммобилизованными поли-dT-олигонуклеотидами, на которых проходит считывание. Шарики случайно наносятся на слайд, и их местоположение декодируется перед началом нанесения на этот слайд образца [33]. Не менее интересной выглядит технология GeoMx, которая уже показала свою эффективность при работе со сложными образцами из парафиновых блоков. Кроме анализа экспрессии генов платформа GeoMx Digital Spatial Profiling (DSP) также предоставляет возможность пространственного профилирования белков. В процессе работы пользователь вручную выбирает интересующие его области клетки с помощью микроскопии. Затем эти области обрабатываются УФ-светом, вызывая высвобождение либо РНК-зонда связанного с транскриптом-мишенью, либо белка, помеченного антителом [34].

Биоинформатический анализ данных при пространственном транскриптомном анализе

Клетки разных типов пространственно и структурно организованы в тканях и выполняют свои разнообразные функции. Расшифровка сложной пространственной архитектуры гетерогенной ткани важна для понимания клеточных механизмов и функций в норме и при различных заболеваниях. Быстрое развитие технологий scRNA-seq позволило начать крупномасштабные исследования гетерогенных клеток и работ по отслеживанию родственных связей внутри ткани. К сожалению, из-за отсутствия пространственной информации scRNA-seq не способен идентифицировать структурную организацию гетерогенных клеток в сложной ткани. Поэтому в качестве дополнения к scRNA-seq были введены методы пространственного профилирования транскриптома. Чтобы выявить пространственную цитоархитектуру в тканях, используют описанные выше технологии, позволяющие проводить количественный анализ транскриптома с пространственным разрешением в отдельных срезах ткани. Технологические новшества и новые подходы в пространственной транскриптомике открыли неизведанный ландшафт, где транскрипционная информация помещается в пространственный контекст. Кластеризация — центральный компонент при анализе данных этого типа. Однако выбор количества кластеров для использования и интерпретация их взаимосвязей могут быть затруднительны [35], [36].

Новые технологии пространственной транскриптомики могут пространственно индексировать транскрипты и измерять профили экспрессии, улучшая наше понимание точной архитектуры тканей. Однако разрешение данных пространственной транскриптомики намного ниже, чем уровень одиночной клетки. Транскрипты, захваченные в определенном месте, обычно представляют смесь из 10–20 клеток. В результате измеренные экспрессии генов отражают хоть и небольшую, но смесь клеток. Следовательно, выявление клеточных составов в каждой точке данных ST имеет решающее значение для исследования молекулярной и клеточной архитектуры ткани с высоким разрешением [36].

К настоящему времени для кластеризации и визуализации данных разработано не так много программных продуктов, хотя определенные успехи в этой области уже появляются, в частности, с использованием искусственного интеллекта и математических моделей удалось определить расположение клеток и транскриптов, синтезируемых в них (рис. 6) [36].

Рисунок 6. Различные уровни разрешения и различные результаты, получаемые в зависимости от использованных методов

Заключение

С появлением NGS-технологий в начале века человечество получило ключи и новые возможности для понимания молекулярных процессов, управляющих жизнью, однако анализ геномов, транскриптомов или эпигеномов представлялся серьезной проблемой при анализе комплексных тканей (кровь, нервная ткань) и органов, состоящих из различных субпопуляций клеток, различающихся по своему функционалу, а значит, и по тем генам, которые в них задействованы. Новые технологии одноклеточного секвенирования и пространственной транскриптомики придают новый импульс развитию современной геномики [18].

Технологии одноклеточного секвенирования дают уникальную возможность изучать молекулярную активность отдельных нервных клеток, визуализируя нейроны во времени и пространстве. Это позволяет изучать эволюцию головного мозга [37], идентифицировать различные типы нейронов и связанных с ними клеток в мозге. На сегодняшний день в головном мозге обнаружено большое число молекулярных типов нейронов, подтипов глиальных клеток [38], [39]. Ожидается, что понимание их работы на молекулярном уровне приблизит врачей к пониманию причины возникновения ряда заболеваний головного мозга, таких как шизофрения [40], болезни Альцгеймера [41] и Паркинсона [42].

Немаловажно использование технологий одноклеточного секвенирования в анализе причин и механизмов течения ряда генетически обусловленных заболеваний человека, в частности, онкологических. Исследования последних лет показали, что генетические или геномные вариации могут приводить к образованию клеток с различными характеристиками в опухолевой ткани, что делает опухолевую ткань очень гетерогенной. Такая высокая степень гетерогенности может быть связана с механизмами онкогенеза и метастазирования, поэтому исследования клеточных субпопуляций, населяющих опухоль, крайне важны [48]. Традиционные методы секвенирования позволяют получать среднее значение сигналов в опухолевой ткани, и генетическая неоднородность опухолевых клеток часто маскируется генетическим материалом наиболее представленной субпопуляции клеток опухоли. Технологии одноклеточного секвенирования могут прекрасно компенсировать недостатки традиционных методов расшифровки генома. Клеточная карта опухолевых клеток может быть построена путем обнаружения гетерогенности опухолевых клеток и пространственной транскриптомики. Технологии ОКС уже сейчас используются при исследовании различных опухолей и имеют большое значение для разработки новых методов диагностики и терапии [48], [49].

Анализ геномного разнообразия прокариот для комплексных образцов — также одна из основных мишеней одноклеточного секвенирования из-за сложности культивирования большинства микроорганизмов. Геномика единичных клеток — это мощный способ получения последовательностей геномов прокариот в отрыве от разработки сложных способов культивирования в лаборатории. Этот подход широко применяется к морским, почвенным, подземным, организменным и другим типам микробиомов для решения широкого круга вопросов, связанных с экологией и эволюцией микроорганизмов, здоровьем человека и потенциальным применением в биотехнологии [50].

Источник