Что такое сверхсинтез веществ микробными клетками

Биосинтез аминокислот

ПРОМЫШЛЕННЫЙ БИО СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Наиболее важные продукты микробиологического синтеза:

В микробиологическом синтезе сложные вещества образуются из более простых в результате функционирования ферментных систем микробной клетки. Этим он отличается от брожения. в результате которого также образуются различные продукты обмена веществ микроорганизмов (спирты, органические кислоты и др.), но преимущественно в результате ферментативного распада органических веществ.

МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ

Первое место здесь по праву занимает Япония, где лишь глутаминовой кислоты изготавливается свыше 100 тысяч тонн в год; большинство природных незаменимых аминокислот производит фирма «Такеда». С. Киношита, впервые в 50-е годы открывший и доказавший перспективность микробного синтеза, уже 1963 году признавал: «Мало сомнения в том, что недалеко то время, когда с помощью микроорганизмов будет возможно производить все известные аминокислоты».

Энзиматический синтез

По данному способу процесс получения аминокислот заключается в синтезе предшественника аминокислоты и последующей его трансформации в целевую аминокислоту с использованием выделенных ферментов или микроорганизмов.

Ферментативный синтез

Данный способ получения аминокислот основан на способности микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, а в определенных условиях — обеспечивать их «сверхсинтез». Основное отличие микробиологической ферментации от энзиматической заключается в использовании не отдельных выделенных, а всех ферментов микроорганизмов.

Продуцентами аминокислот в биосинтезе наиболее часто служат бактерии, относящиеся к родам Corynebacterium, Brevibacterium, Escherishia. Субстратом при производстве аминокислот является углеводное сырье (меласса, гидролизаты крахмала и целлюлозы), этанол, уксусная или другие органические кислоты, а также углеводороды. В качестве источника азота используют соли аммония, нитраты, а также аминокислоты.

У микробиологического синтеза есть свои преимущест­ва и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется от­носительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые организмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к ма­лейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получа­ется низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры.

Биосинтез аминокислот. Общие принципы.

Большинство остальных аминокислот получает свою аминогруппу от одной из первичных аминокислот в результате трансаминирования. Из свободных аминокислот в цитоплазме количественно преобладает глутаминовая кислота (больше половины всего «пула» аминокислот).

У ряда микроорганизмов хорошо изучены пути синтеза всех двадцати аминокислот. Исходным материалом для синтеза служат простые промежуточные продукты обмена (пируват, 2-оксоглутарат, оксалоацетат или фумарат, эритрозо-4-фосфат, рибозо-5-фосфат и АТР). При синтезе большинства аминокислот аминогруппа вводится только на последнем этапе путем трансаминирования. Некоторые аминокислоты образуются в результате ряда превращений других аминокислот, и в этих случаях трансаминирования не требуется. Аминокислоты можно подразделить на группы, исходя из путей их синтеза (рис. 7.17). Синтез различных аминокислот включает разное число этапов, катализируемых ферментами. Примечателен тот факт, что аминокислоты, которые человек должен получать в готовом виде, синтезируются особенно длинным путем.

Относительно быстрое выяснение путей биосинтеза аминокислот и других соединений стало возможным благодаря использованию ауксотрофных мутантов грибов и особенно бактерий. Ауксотрофность многих мутантов обусловлена утратой способности к образованию какого-то фермента, участвующего в биосинтезе. Для роста мутанта нужен в этом случае конечный продукт того пути биосинтеза, который блокирован из-за выпадения функции фермента. Эти мутанты обладают еще одним ценным свойством: они растут не только в присутствии конечного продукта блокированного пути, но и в присутствии промежуточных продуктов, образующихся на отрезке между блокированным этапом и конечным продуктом. В то же время субстрат для блокированной реакции часто накапливается: если, например, отсутствует фермент b, то в среду выделяется промежуточный продукт. Благодаря этому некоторые мутанты, у которых блокированы разные этапы одного и того же пути синтеза, могут снабжать друг друга недостающими веществами. Мутант с блоком на более позднем этапе (отсутствие фермента d) обеспечивает недостающим промежуточным продуктом клетки другого мутанта с блоком на более раннем этапе (отсутствие фермента b). В результате таких опытов удается расположить определенных мутантов в ряд, в котором каждый предшествующий мутант будет поддерживать рост всех следующих за ним. Путем анализа накапливающихся промежуточных продуктов, выделения и очистки ферментов, а также с помощью других методов удалось уже выяснить многие пути биосинтеза.

Подробнее о промышленном получении аминокислот

Аминокислоты. Промышленное производство.

ВВЕДЕНИЕ. Аминокислоты стали получать в промышленности примерно в середине 60-х годов XX века, после того как были изучены важнейшие этапы обмена веществ. После этого некоторые аминокислоты стали использоваться в медицине, например для приготовления инфузионных растворов, другие (L-метионин, L-лизин и L-треонин) – в качестве кормовых добавок. Объем производства аминокислот значительно увеличился с тех пор, как было обнаружено, что L-глутамат может усиливать вкус, а дипептид аспартам обладает выраженным сладким вкусом. Молекулы всех белков построены из 20 протеиногенных аминокислот. Некоторые аминокислоты не могут синтезироваться в организме, а должны поступать вместе с пищей (незаменимые аминокислоты). Для человека и многих сельскохозяйственных животных незаменимыми аминокислотами являются L-метионин, L-лизин, ароматические аминокислоты (L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан) и гидрофобные аминокислоты (L-валин, L-лейцин и L-изолейцин). В природе также встречаются «небелковые» аминокислоты, например D-изомеры аминокислот. Их используют в синтетической химии, в том числе при производстве полусинтетических антибиотиков.

ЭКОНОМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ. Производство аминокислот составляет более 2 000 000 т/год, что оценивается в сумму более 4 млрд долларов США. Значительная часть предприятий, производящих аминокислоты, расположена в азиатском регионе. Лидирует производство L-глутамата натрия (более 1 500 000 т/год), за ним следуют производства L-лизина (700 000 т/год) и L-метионина (600 000 т/год). L-Аспарагиновая кислота и L-фенилаланин – сырье для получения подсластителя аспартама – производятся в количествах 10 000 т/год. Около 65% производимых аминокислот используются в пищевой промышленности, 30% – как кормовые добавки для скота и лишь 5% аминокислот после дополнительной очистки применяют в медицинских целях, прежде всего для инфузионных растворов, а также в производстве косметических препаратов.

ПОЛУЧЕНИЕ.

Существует четыре промышленных метода получения аминокислот: 1) экстракция из гидролизата белка; 2) химический синтез; 3) биотрансформация соединений-предшественников в ферментере или клеточном реакторе; 4) микробная ферментация.

Экстракцией из белкого гидролизата в промышленности получают прежде всего L-цистеин, L-цистин, L-лейцин, L-аспарагин, L-аргинин и L-тирозин. В качестве сырья используют растительные белки или отходы мясной промышленности, которые подвергают кислотному гидролизу, после чего путем кристаллизации или экстракции спиртом отделяют гидрофобные аминокислоты L-фенилаланин, L-лейцин и L-изолейцин. Затем проводят ионообменную хроматографию, разделяя растворимые аминокислоты на основную, кислую и нейтральную фракции, которые далее перекристаллизовывают и подвергают хроматографической очистке. Химический синтез аминокислот всегда приводит к образованию рацемата (смеси L- и D-изомеров аминокислот), который также находит применение. Например, L,D-метионин применяется в качестве кормовой добавки, L,D-аланин добавляют во фруктовые соки для смягчения вкуса. Для разделения рацематов аминокислот на L- и D-изомеры в молекулу аминокислоты вводят еще один хиральный центр при Сα-атоме. Такие реакции биотрансформации осуществляют в ферментере или клеточном реакторе. Биокатализатором могут служить очищенные ферменты или целые клетки, содержащие необходимый фермент. Экономически выгодно использовать иммобилизованные биокатализаторы, которые позволяют проводить реакцию непрерывно в течение длительного срока. Успех промышленного получения аминокислот объясняется тем, что химический синтез соединений-предшественников относительно дешев. Кроме того, для производства практически всех протеиногенных аминокислот разработаны методы ферментации, и имеются штаммы, позволяющие получать большие количества продукта. Во многих случаях такой подход экономически оправдан. Широко используются штаммы, усовершенствованные методами генетической инженерии. К настоящему времени закончено секвенирование генома Corynebacterium glutamicum. Полученная генетическая информация поможет ускорить создание новых высокопродуктивных штаммов. Во многих случаях уже клонированы целые опероны, ответственные за биосинтез аминокислот. Изучаются возможности управления обменом веществ клетки методами так называемой метаболической инженерии.

L-Глутаминовая кислота

ВВЕДЕНИЕ. В 1908 г. японские ученые установили, что L-глутаминовая кислота, содержащаяся в водорослях Konbu, может усиливать вкус. Промышленное производство L-глутаминовой кис лоты из кислотного гидролизата клейковины пшеницы и соевого белка было начато уже в 1909 г. на фирме Ajinоmoto. В 1957 г. сотрудник фирмы Киова Хакко обнаружил, что при выращивании Corynebacterium glutamicum в сахаросодержащей среде накапливается L-глутаминовая кис лота. В настоящее время в результате усовершенствования штамма и оптимизации технологии ферментации удается получать до 150 г глутамата из 1 л культуры.

МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСИНТЕЗ. В клетках C. glutamicum L-глутаминовая кислота образуется при трансаминировании 2-оксоглутаровой кислоты, которая получается при окислении изолимонной кислоты в цикле Кребса. В диком штамме окисление дикарбоновых продуктов цикла Кребса строго регулируется. Изучение генома C. glutamicum и способов регуляции активности ферментов привело к созданию нового штамма, в котором: 1) возросла секреция глутамата в среду роста; 2) изменены пути регуляции активности некоторых ферментов, участвующих в биосинтезе L-глутаминовой кислоты; 3) активированы некоторые побочные пути обмена веществ.

1. Количество глутамата в культуральной жидкости в большой степени зависит от скорости секреции, и, следовательно, от проницаемости цитоплазматической мембраны. Проницаемость мембран может изменяться. Например, для увеличения проницаемости ограничивают доступ биотина, жирных кислот или глицерина (для ауксотрофов по жирным кислотам или по глицерину соответственно). Добавление в среду пенициллина также приводит к повышению проницаемости клеточной стенки, так как пенициллин препятствует ее образованию.

2. В промышленных штаммах C. glutamicum активность оксоглутаратдегидрогеназы значительно ниже активности L глутаматдегидрогеназы (K_М различаются примерно в 70 раз, V_max – примерно в 150 раз).

3. К наиболее важным анаплеротическим реакциям относятся карбоксилирование фосфоенолпирувата и активация глиоксилатного цикла (в растениях и бактериях). Обе реакции приводят к образованию оксалоацетата, предшественника цитрата, кроме того, в результате этих реакций происходит включение дикарбоновых (С₂) продуктов гликолиза в цикл лимонной кислоты. Фосфоенолпируваткарбоксилаза использует в качестве кофактора биотин, следовательно, изменяя количество биотина, можно регулировать активность фермента. Активность многих ферментов, участвующих в глиоксилатном цикле, зависит от концентрации метаболитов, конечных продуктов, а также NH₄ + и NAD + / NADH, поэтому можно «искусственно» менять их активность. Выход продукта в штаммах-продуцентах глутамата можно повысить методами генетической инженерии. В настоящее время геном C. glutamicum полностью расшифрован и активно изучается. В частности, исследуют зависимость выхода продукта от введения в геном мультикопийных кассет, несущих ген глутаматдегидрогеназы.

ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. L-Глутамат используется в основном в пищевой промышленности как усилитель вкуса, чаще всего в комбинации с нуклеозидами. В 2004 г. путем ферментации было получено 1500000 т L-глутамата. Рыночная стоимость L-глутамата составляет 1000 долларов США за тонну, а объем рынка достигает 1,5 млрд долларов США. Основные производства расположены в странах азиатского региона.

D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин

D,L-МЕТИОНИН. Химический синтез D,L-метионина, L-лизина и L-треонина включает пять стадий. В качестве исходных веществ используют акролеин, метантиол и синильную кислоту. Одним из промежуточных продуктов синтеза является гидантоин – консервант, использующийся при производстве шампуней и моющих средств. В процессе химического синтеза образуется рацемат, в разделении которого нет необходимости, поскольку в организме высших животных D-метионин превращается в L-метионин.

L-ТРЕОНИН. Мутантные штаммы Escherichia coli с измененным путем регуляции биосинтеза являются основными промышленными продуцентами L-треонина. Максимальный выход продукта составляет 80 г/л через 30 ч роста. Уже клонированы гены оперона, отвечающего за биосинтез треонина, и в настоящее время ведутся работы, направленные на получение штаммов с еще более высоким выходом продукта. После отделения клеток проводят ультрафильтрацию культуральной жидкости, а затем L-треонин очищают кристаллизацией.

ЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ. В 2004 г. было произведено 600000 т D,L-метионина, 700 000 т L-лизина и 55 000 т L-треонина. Метионин получают преимущественно путем химического синтеза, а L-лизин и L-треонин – ферментацией. Стоимость этих аминокислот 1000–2000 долл. США/т, а объем продаж достигает 500 млн долл. В последнее время наряду с традиционным производством аминокислот для кормовых добавок развивается новая технология – выращивание трансгенных растений с измененным аминокислотным составом. Такие растения в перспективе могут использоваться непосредственно для откорма скота.

ВВЕДЕНИЕ. Аспартам (метиловый эфир L-α-аспартил-L-фенилаланина) – это низкокалорийный искусственный подсластитель, который по сладости в 200 раз превосходит сахар, полученный из сахарной свеклы. Объем производства аспартама составляет 30 000 т/г (2004). Исходными веществами для синтеза аспартама являются L-аспарагиновая кислота и L-фенилаланин. При химическом синтезе аспартама требуются дополнительные затраты на введение защитных групп в молекулы исходных веществ, поэтому в настоящее время применяют ферментативные методы получения этого продукта.

L-АСПАРАГИНОВАЯ КИСЛОТА. Одним из методов получения L-аспарагиновой кислоты является экстракция из белкового гидролизата, однако экономически более выгодным оказался синтез клетками Escherichia coli из фумаровой кислоты в присутствии аммиака. Реакцию осуществляет фермент аспартаза, находящаяся в клетках микроорганизма. Как правило, для выращивания клеток используют реактор, в котором бактерии иммобилизованы на κ каррагинане или полиакриламиде. Выход продукта в такой системе достигает 140 г/(л*ч), а срок службы биокатализатора на основе иммобилизованных клеток составляет два года. Использование сублимированных клеток промышленных штаммов позволяет получать до 166 г L-аспарагиновой кислоты с литра клеточной культуры. В лабораторных условиях удалось получить штамм E. coli с плазмидой, несущей ген аспартазы (aspA). В таком штамме выход L-аспарагиновой кислоты увеличивается в 30 раз.

L-ФЕНИЛАЛАНИН. Традиционно производство L-фенилаланина осуществлялось в ферментативных реакторах на доступном сырье. В последнее время в связи с развитием молекулярно-биологических методов, позволяющих получать генетически модифицированные штаммы-суперпродуценты, все шире используют ферментацию. Распространение ферментативных методов объясняется доступностью и невысокой стоимостью синтетического сырья, а также выгодным соотношением между производственными площадями, временными затратами и выходом продукта. Для производства L-фенилаланина наиболее выгодным оказалось использование биореактора, в котором в присутствии аммиака происходит аминирование коричной кис лоты под действием фермента фенилаланинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis. В таком реакторе выход продукта достигает 50 г/л, а эффективность переработки сырья составляет 83%. Перспективным также считается метод расщепления D,L-5-бензилгидантоина ферментами L-гидантоиназой и L-N-карбамоилазой, выделенными из Flavobacterium ammoniagenes. Для ферментации в биореакторах в современном производстве, как правило, используют штаммы-суперпродуценты E. coli или коринебактерий. В этих организмах биосинтез L-фенилаланина из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата протекает в несколько стадий. В качестве промежуточных соединений образуются шикимовая, префеновая и фенилпировиноградная кислоты, в диком штамме они предшественники L-триптофана и L-тирозина. Однако в промышленности используют мутантные ауксотрофные штаммы, в которых активность ключевых ферментов строго регулируется. Практически все гены, продукты которых участвуют в биосинтезе L-фенилаланина, к настоящему времени клонированы. Это позволяет получать новые штаммы-суперпродуценты, применяя генно-инженерные методы. Так, выход L-фенилаланина в одном из рекомбинантных штаммов Brevibacterium fermentum составляет 45 г на литр клеточной культуры. После завершения ферментации по воздушно-проточному способу клетки отделяют, а затем концентрируют культуральную жидкость ульрафильтрацией. Для окончательной очистки L-фенилаланина применяют ионообменную хроматографию или кристаллизацию.

АСПАРТАМТМ. Для синтеза аспартама из L-аспарагиновой кислоты и L-фенилаланина необходимо сначала ввести в исходные молекулы пять защитных групп, а в конце синтеза их удалить. Такой метод значительно сложнее синтеза с использованием протеиназы. В обычных условиях протеолитические ферменты катализируют гидролиз пептидных связей, однако возможно сдвинуть равновесие в сторону образования пептидной связи. Так, в концентрированных растворах, содержащих L-аспарагиновую кислоту (в которой аминогруппа защищена бензилоксикарбонилом) и метиловый эфир L-фенилаланина, протеиназа катализирует образование малорастворимого пептида, который выпадает в осадок. Особенно важно, что в этой реакции принимает участие только α-карбоксильная группа L-аспарагиновой кислоты, так как изомер аспартама – метиловый эфир L-β-аспартил-L-фенилаланина – обладает сильно выраженным горьким вкусом. В промышленном производстве, как правило, используют иммобилизованную протеиназу термолизин, выделенную из Bacillus thermoproteolyticus. Этот фермент устойчив к высоким температурам и может осуществлять реакцию при 70°С, что значительно повышает эффективность процесса (выход продукта достигает 30 г/л). Образовавшийся аспартам в значительной степени отделен от побочных продуктов, так что для окончательной очистки от примеси исходных веществ достаточно ионообменной хроматографии.

Получение L-аминокислот путем ферментативной транс формации

ВВЕДЕНИЕ. Как мы уже видели на примере L-лизина, L-аспарагиновой кислоты и L-фенилаланина, тот или иной энантиомер аминокислоты можно получить путем ферментативных превращений предшественников. В отличие от ферментации использование энантиоспецифичных ферментов позволяет синтезировать небелковые аминокислоты. Для этой цели наиболее широко используют гидролазы, селективно расщепляющие определенные энантиомеры в рацемате. В качестве примера можно привести эстеразы, аминоацилазы, амидазы и гидантоиназы. Недостаток метода заключается в необходимости удаления «неправильного» энантиомера из реакционной смеси, его рацемизации и повторного введения в реакцию. В другом методе используются реакции присоединения, катализируемые лиазами (например, оксинитрилазами), или окислительно-восстановительные реакции, катализируемые оксидоредуктазами; в этих реакциях образуются только «правильные» энантиомеры.

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ. Наиболее хорошо изучены и активно применяются в современных промышленных процессах аминоацилазы и гидантоиназы. Для осуществления гидролиза рацемата N-ациламинокислот используют иммобилизованную ацилазу, выделенную из Aspergillus oryzae или Baсillus thermoglucosidius. В реакции участвуют только L-энантио меры, а N-ацил-D-аминокислоты, оставшиеся в реакционной смеси после кристаллизации L-аминокислот, подвергают термической рацемизации и снова вводят в реакцию. Таким способом ежегодно производят сотни тонн L-метионина, L-тирозина, L-пролина и L-валина для медицинских нужд. Аналогичным образом можно получать и D-аминокислоты, однако более выгодно использовать доступные предшественники аминокислот – гидантоины. После расщепления гидантоинов специфическими гидантоиназами образуются N-карбамоил-аминокислоты, которые в свою очередь могут быть превращены в D- или L-аминокислоты при помощи карбамоилаз. «Ложный» гидантоин прекращает ферментативную рацемизацию и в ходе оптимизированного путем генетических технологий ферментативного каскада приводит к количественному выходу абиогенных L- и D-аминокислот. Свойство «неправильного» гидантоина рацемизоваться при рН 8,5 легло в основу нового метода, перспективного для промышленного получения D-фенилглицина и 4-гидроксифенилглицина – важных предшественников полусинтетических пенициллинов ампициллина и амоксициллина.

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ.

Для осуществления реакций, специфичных для R- и S-энантиомеров, используют соответствующие оксинитрилазы – ферменты из растительных тканей. В настоящее время R- и S-оксинитрилазы получены в виде рекомбинантных белков в клетках E. coli; при этом ген R-оксинитрилазы клонирован из маниока, а ген S-оксинитрилазы – из миндаля. Определена пространственная структура обоих ферментов и с помощью методов белковой инженерии предприняты попытки усовершенствовать ферменты для промышленного применения.

ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫЕ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ.

На примере стереоселективного синтеза L-лейцина из α-оксоизокапроновойкислоты видно, что для восстановительного аминирования с помощью L-лейциндегидрогеназы из Bacillussp. кроме NH₃ необходим NADH. Ввиду высокойстоимости кофермента необходимо создать системуего регенерации. Очень элегантно эта проблема решена в случае формиатдегидрогеназы из Candida boidinii: CO₂ – один из побочных продуктов реакции –сдвигает равновесие в сторону образования L-лейцина. Использование NADH, связанного с полиэтиленгликолем (ПЭГ), позволяет получать до 600 000 молярных эквивалентов продукта из одного моля NADH.В промышленности восстановление NADH в окислительно-восстановительных реакциях происходит нанеизменяющемся коэнзиме в порционном режиме. Еще более интенсивно подобный процесс происходитс участием измененных (путем Protein Design или направленной эволюции) ферментов в генетически модифицированных микроорганизмах.

См. дополнительно:

Будьте здоровы!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

Источник